Insuliinipreparaatide analüüsimise ja standardimise meetodite väljatöötamine ja ühtlustamine pöördfaasilise kõrgsurvevedelikkromatograafia abil (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

  • Diagnostika

See väitekirja peaks lähitulevikus raamatukogu juurde minema.
Teavitage sissepääsust

Töö - 480 rubla., Kohaletoimetamine 10 minutit, ööpäevaringselt, seitse päeva nädalas ja pühad.

Abstraktne - 240 rubla, kohaletoimetamine 1-3 tundi, 10-19 (Moskva aeg), välja arvatud pühapäev

Pihtar Anatoli Vasilyevich. Insuliinipreparaatide analüüsimise ja standardimise meetodite väljatöötamine ja ühtlustamine pöördfaasilise kõrgsurvevedelikkromatograafia (RP HPLC) abil: väitekiri. Farmaatsiateaduste kandidaat: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Kaitse koht: Moskva meditsiiniakadeemia].- Moskva, 2005.- 139 lk.: Il.

Väitekirja sisu

1. PEATÜKK Kirjanduse ülevaade 11

1. Insuliini roll suhkurtõve ravis 11

2. Insuliini biosüntees ja bioloogiline toime 12

3. Insuliini füüsikalis-keemiliste ja farmatseutiliste omaduste üldised omadused 15

4. Insuliini preparaadid 24

5. Insuliinipreparaatide tootmise meetodid, standardimine ja kvaliteedikontroll 31

6. HPLC kasutamine insuliini farmatseutilises analüüsis. 46

2. PEATÜKK Probleemi avaldus 50

3. PEATÜKK Uuring erinevate tegurite mõju kohta insuliini kromatograafilisele käitumisele RP HPLC tingimustes 56

1. Meetodid ja materjalid 57

2. Tulemuste arutamine 62

2.1. Puhverlahuse 62 koostise mõju

2.2. Naatriumsulfaadi kontsentratsiooni mõju 68

2.3. Kromatograafilise kolonni temperatuuri 70 mõju

2.4. Orgaanilise modifitseerija 75 mõju

2.5. Pookitud faasi alküülradikaali pikkuse 80 mõju

2.6. Kromatograafilise kolonni 80 pikkuse mõju

4. PEATÜKK. Farmakopöa meetodite täiustamine insuliinipreparaatide analüüsimiseks RP HPLC 82 alusel

1. Optimaalsete tingimuste valimine insuliini ja selle lisandite kromatograafiliseks määramiseks ravimpreparaatides 82

2. Meetodi metroloogilised omadused 84

3. Välja töötatud metoodika rakendamine ametlike insuliinipreparaatide testimiseks 95

5. PEATÜKK PF HPLC meetodil põhinevate isofaan-insuliini süstitavate annusvormide analüüsimeetodite väljatöötamine 107

1. Protamiini kromatograafilise määramise tingimuste valik isofaan-insuliini annusvormides 110

2. Erinevatest kalaliikidest eraldatud protamiinide kromatograafiliste profiilide uurimine 121

3. Meetod protamiini määramiseks isofaan-insuliini preparaatides 123

4. Välja töötatud metoodika valideerimine 125

Üldised järeldused 136

Viited 139

Insuliini füüsikalis-keemiliste ja farmatseutiliste omaduste üldised omadused

Keemilisest vaatepunktist on insuliin väikeseks globulaarseks valguks, mille molekulmass on kuni 6000 Da. Samal ajal tuleb märkida, et insuliin on üldine loodusliku ja kunstliku päritoluga homoloogiliste valkude perekond, millel on ühine iseloomulik bioloogiline aktiivsus. Insuliini valgu olemus loodi 1928. aastal [52]. See on valkude seas, mis tekitavad biureetreaktsiooni ja Pauli reaktsiooni. Insuliini struktuur oli täielikult välja kujunenud 50ndate alguses. Eri päritoluga insuliinide elementaarset keemilist koostist iseloomustab tabelis 1 toodud arvud [40].

Aminohapete koostis. Enamik insuliinimolekule sisaldavad 51 aminohappejääki, sealhulgas 17 aminohapet, mis on leitud enamikus tuntud valkudes.

Veiste, sigade ja iniminsuliini aminohapete koostise iseloomulik tunnus on trüptofaan ja metioniin. Nende insuliinitüüpide aminohappeline koostis on esitatud tabelis 2 [40,46].

Kõikide insuliinitüüpide puhul on tsüstiini sisaldus (6 pooltsüstiini jääki). Lisaks sisaldab igat tüüpi insuliinimolekul 6 amiidrühma (asparagiin, glutamiin).

Kui insuliin vabaneb, võib koos peamise fraktsiooniga täheldada insuliini deamüdeeritud vormide fraktsioone. Happelises keskkonnas, deamideerimise protsessis, võib kõik 6 amiidi rühma järk-järgult eraldada ning insuliini muutuste elektroforeetiline ja kromatograafiline liikuvus [40]. Deamidaaditud insuliinivormide moodustumist võib hinnata ammoniaagi määramise tulemuste põhjal. Insuliini täielikult amiidvormi jaoks määratakse 6 mooli ammoniaaki 1 mooli valgu kohta, deamideeritud vormide puhul võib see väärtus olla 5 kuni 0.

Insuliini esmane struktuur. Insuliini esmase struktuuri dekodeeris Sanger grupp 1945-1955. Kasutades mitmeid kromatograafilisi meetodeid, mis võimaldasid eraldada ja identifitseerida erinevaid peptiide, aminohappeid ja nende derivaate, suutis Sanger tuvastada veise insuliini primaarse struktuuri [130, 131, 132, 133, 134, 135]. Erinevate päritoluga insuliinide edasised uuringud, kasutades mitmesuguseid füüsikalis-keemilisi meetodeid, kaasa arvatud Edmani meetod aminohappejärjestuse määramiseks pikkades peptiidides, kinnitas Sanger ja tema kaasautorite järeldusi insuliini struktuuri kohta [bb].

Praeguseks on insuliini esmane struktuur kindlaks määratud nelja loomaliigi 24 liigi esindajate hulgas: imetajad, linnud, kalad ja tsüklostoomid [14]. Jätkuvad erinevate päritoluga insuliini uuringud [71,72,73].

Insuliini struktuur erinevates loomades on sarnane, kuid mitte identne. Iniminsuliin on oma esmases struktuuris sarnane sigade, koerte, sperma vaalade ja küüliku insuliinidega, mis erinevad ainult ühest aminohappest [40]. See erineb veisinsuliinist kolme aminohappega. Iniminsuliin ei ole enam sarnane Guinea sea, lindude ja kalade insuliiniga [40]. Inimese, sigade ja veiste insuliinide aminohappejärjestuse erinevused on toodud tabelis 3.

Vaatamata struktuurilistele erinevustele on kõikidel insuliinitüüpidel sarnane bioloogiline aktiivsus, s.t. põhjustada hüpoglükeemilist toimet. Näidatud bioloogilise aktiivsuse ulatus sõltub aga tugevalt liigist ja on vahemikus 11 RÜ / mg (Põhjamere tursaminsuliin) kuni 62 RÜ / mg (kalkun ja kana insuliin), samas kui inimese insuliini aktiivsus on umbes 25-30 IU. / mg [40]. Mida suurem on eri liikide vahelised erinevused, seda suurem on vastava insuliini bioloogilise aktiivsuse erinevus.

Funktsionaalselt aktiivne insuliinimolekul koosneb kahest polüpeptiidahelast (A ja B ahelad), mis on seotud disulfiidsidemetega; ühe sideme moodustavad mõlema ahela seitsmes aminohappejääk, teine ​​disulfiidsidem moodustub A-ahela 20. jäägi ja B-ahela 19. jäägi poolt (joonis 2). Lisaks on insuliinimolekulis kolmas disulfiidsidem, mis on intrakaiin ja ühendab 6. ja 11. A-ahela jäägid [59,117].

Sekundaarne struktuur Kasutades erinevaid füüsikalis-keemilisi ja füüsikalisi uurimismeetodeid, näidati, et insuliinimolekulil on kõrgelt korraldatud ruumiline struktuur (konformatsioon), mis aitab kaasa spetsiifiliste bioloogiliste funktsioonide rakendamisele [14]. Natiivse insuliini molekulis on samaaegselt olemas nii cc-heeliks kui ka p-fold lehed. Lisaks sellele on piirkondi, kus on korrastamata struktuur ja struktuur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Kui insuliini happelist lahust (pH 2,3-2,5) kuumutatakse temperatuuril +100 ° C ja jahutatakse kiiresti temperatuurini -80 ° C, moodustub nn fibrillaarne insuliin - hormooni täiesti inaktiivne vorm [27]. Fibrillaarse insuliinikiudude sisseviimine aktiivse insuliini lahusesse põhjustab spontaanset kvantitatiivset insuliini sadestumist fibrillide kujul [14,17].

Insuliinipreparaatide tootmise meetodid, standardimine ja kvaliteedikontroll

Loomade insuliiniliikide saamine. Veiseliha ja sealiha insuliini tööstuslik tootmine loodi peaaegu samal ajal paljudes riikides, kohe pärast insuliini avastamist 1921. aastal [63]. Sellest ajast alates on insuliini saamise mõiste praktiliselt muutunud (tabel b) [17, 18]. Insuliini loomaliikide tootmiseks kasutatavad toormaterjalid on toidu jaoks kasutatavate tapaloomade kõhunääre.

Insuliini tootmise kõige olulisem ülesanne on selle puhastamine - ainete eraldumine seonduvatest lisanditest, mis vähendavad bioloogilist aktiivsust, põhjustavad immunoloogilisi reaktsioone või on potentsiaalselt ohtlikud patsiendi tervisele. Näiteks pärast mitme aasta möödumist, kui kasutati patsiendi veres halvasti puhastatud insuliini, võib antikehadega seonduda kuni 5000 RÜ insuliini. Insuliinivastased antikehad mõjutavad oluliselt selle toime profiili ja aitavad seega kaasa labiilse diabeedi kulgemisele.

Esimene meetod insuliini puhastamiseks oli ümberkristallimine tsingisoolade juuresolekul. 1945. aastal näidati, et insuliini seitsmekordne ümberkristallimine vähendab oluliselt allergiliste reaktsioonide taset patsientidel võrreldes ametlike insuliinipreparaatidega sel ajal [63].

Insuliiniproovide heterogeensust pärast kristallimist ja ühekordset ümberkristallimist on näidatud mitmesuguste meetoditega: vastuvoolu ekstraheerimine (PE), jaotuskromatograafia (PX), ioonivahetuskromatograafia (IOC), diskelektroforees (DEP) ja geelist väljatõrjumise kromatograafia (GEC) [63].

Leiti, et peamised kaasnevad insuliini lisandid on: proinsuliin, selle vahesaadused, kovalentne insuliindimeer, mono-disamido insuliin, monoarginiin ja mono-etüleen, samuti mitmed suure molekuliga ühendid, mis ei ole insuliini. Uuringute tulemuste üldine järeldus, võttes arvesse teavet tuvastatud lisandite immunoloogilise aktiivsuse kohta [138], oli järeldus insuliinainete täiendava puhastamise vajaduse kohta, nii et DEF- ja GEC-meetodite analüüsimisel leiti üks komponent - vastav insuliin.

Insuliini puhastamise probleemi lahendamiseks 1950. aastal pakuti välja HEC-meetod ja 1970. aastal anioonivahetuskromatograafia (AOX) meetod. Leiti, et AOX-meetodil puhastatud insuliin sisaldab proinsuliini aktiivsusega umbes 500 ppm (miljondikku osa) lisandeid [137]. Insuliini täiendav puhastamine kõrgsurvevedelikkromatograafia abil pöördfaasidel (RP HPLC) vähendab immunogeensete fraktsioonide sisaldust nende avastamise piirini [63].

Insuliini kromatograafilise puhastamise valdkonna praeguste arengute ülevaade on esitatud [96]. Insuliini, mis on puhastatud järjestikku, kasutades IOC ja GEC, nimetatakse monokomponendiks olevaks insuliiniks [63]. Iniminsuliini saamine. Iniminsuliini saamise meetodite otsimine oli tingitud kahest asjaolust. Ühest küljest andis tooraineprobleemi kiireloomulisus loominsuliini tootmise puhul aga teaduse kiire areng selles valdkonnas tõelise võimaluse selle idee ellu viia. 1979. ja 1981. aastal peaaegu samal ajal töötati välja kaks meetodit iniminsuliini saamiseks - biosünteetilised ja poolsünteetilised [102,108]. 1981. aastal alustas ettevõte Novo Nordisk esimest korda maailmas poolsünteetilise insuliini tootmist. Ettevõtte kasutatav meetod põhineb Ali ensümaatilisel ja keemilisel asendamisel sigade insuliini molekulis ülejäänud Tre [61] -ga. See meetod sõltub otseselt vajaliku koguse seainsuliini saamisest, mis vähendab selle majanduslikku väärtust. Rekombinantse DNA tehnoloogia väljatöötamisel ilmnes võimalus saada biosünteetilise meetodiga iniminsuliini [10]. Umbes 25 aastat tagasi algas geneetiliselt muundatud insuliinitootmine. 1978. aastal teatati, et saadi roti proinsou-lingit tootev E. coli tüvi. 1979. aastal suutis Genentechi uuringud kloonida aminohappejärjestusi kodeerivad geenid E. coli. pBR322 plasmiidi p-halo-takidaasi piirkonnas sisalduvad insuliiniahelad A ja B [10102]. 1981. aastal sünteesiti mini-C-proinsuliini proinsuliini geenianaloog, milles 35-liikmeline C-peptiid asendati kuue aminohappe segmendiga: arg-arg-glütser-lys-arg ja selle ekspressioon E. colis. 1982. aastal alustas ettevõte Eli Lilly maailma esimest iniminsuliini tööstuslikku tootmist, kasutades kahesahelist tehnoloogiat, mis töötati välja koostöös Genentechiga [102]. Praegu on näidatud võimalust saada iniminsuliini erinevate ekspressioonisüsteemide abil [3,10,101,102]. Majanduslikust seisukohast on eriti huvipakkuvaks geneetiliselt muundatud geen-positiivsete E. coli bakterite kasutamine, millest paljud loetakse ülemäärasteks tootjateks [3]. Samal ajal saavutati märkimisväärne edu Saccharomices cerevisiae pärmirakkudega [3,75]. Tabelis 7 on loetletud peamised rekombinantse iniminsuliini tootmise meetodite ühised, tehnoloogilise protsessi etapid [3,10,63].

Välja töötatud metoodika rakendamine ametlike insuliinipreparaatide testimiseks

Kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) on kolonnis kasutatava vedelikkromatograafia variant, milles liikuv faas - eluent - läbib kolonni täitva sorbendi suure kiirusega (kuni 400x105 Pa) kolonni sissepääsu juures [11].

Komplekssete ainete segude analüüsiks ilmnes HPLC veidi üle 30 aasta tagasi. Sorbentide kasutamine osakeste läbimõõduga 3–10 μm põhjustas kromatograafilise eraldamise tõhususe järsu tõusu võrreldes klassikalise kolonnivedelikkromatograafia versiooniga. Seetõttu nimetatakse HPLC-d sageli kõrgsurvevedelikkromatograafiaks (HPLC). HPLC kasutamise instrumentaalseid omadusi on üksikasjalikult kirjeldatud arvukates käsiraamatutes [49.50] ja juhtivate farmakopöade asjakohastes osades [79,150]. HPLC jaoks on välja töötatud ja toodetud suur hulk sorbente. Uuringu autorite [51] andmetel toodavad umbes 100 ettevõtet kogu maailmas rohkem kui 300 sorbendi nime. Metoodika ajalugu, praegune olukord ja väljavaated on arutatud ülevaadetes [51] ja [77.78].

Oma mitmesugustes variantides kasutatakse HPLC meetodit laialdaselt farmatseutilises analüüsis (tootmise kontroll ja ravimikvaliteedi testimine). Meetod on lisatud maailma juhtivatele farmakopöadele. Seda meetodit kirjeldatakse kõige paremini Euroopa ja Ameerika farmakopöades. HPLC-d kasutatakse ravimite identifitseerimiseks, et määrata puhtus, molekulmassi fraktsiooniline koostis ja kvantitatiivne analüüs. USA farmakopöas 28 ed. umbes 30% eratoodetest on seotud HPLC-ga. Euroopa farmakopöas 4. väljaanne. see arv on umbes 40%.

Esimene insuliinianalüüsi kromatograafia meetod oli madala rõhuga geelist väljutamise vedelikkromatograafia (GE ZhND). HPLC tingimustes eraldamise põhimõte põhineb erinevate suurustega molekulide erinevatel võimetel tungida neutraalse geeli pooridesse, mis toimib statsionaarse faasina. Insuliinmonomeeri ja dimeeri hüdrodünaamiline diameeter on proportsionaalne nende molekulmassiga ja on vastavalt 2,69 ja 5,50 nm [115].

1967. aastal, kasutades GE-IHDD meetodit, näidati, et kristallimisega puhastatud insuliini kaubanduslikud preparaadid sisaldavad lisandeid, mille molekulmass ületab insuliini molekulmassi [63]. Sigade insuliini kromatogrammidel leiti kolm piiki, mida tavapäraselt nimetati a-, b- ja c-komponentideks. Sellest ajast alates on pakutud mitmeid kromatograafilisi süsteeme, et reguleerida suure molekulmassiga lisandite sisaldust insuliinipreparaatides. Eraldamine viidi läbi väga punduvatel agaroos-kserogeelidel (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Või dekstraan (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), etüülhappe lahustena kasutati 1-3 M lahust [127]. Nende sorbentide kõrge tundlikkus maatriksi paisumisrõhku ületavate survetegurite survestamisel muudab need materjalid HPLC-režiimis kasutamiseks sobimatuteks.

Geelist väljutamise vedelikkromatograafia kasutamist kõrge rõhu juures (GE HPLC) insuliinianalüüsi jaoks kirjeldati esmakordselt 1980. aastal pärast kõvade makropoorsete sorbentide väljatöötamist, mis sobivad kokku veega ja talusid kõrget survet. [151] teostati eraldamine kolonnidel Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) denatureerimise tingimustes (7M uurea, mineraalhapete ja mitteioonsete lahuste kombinatsioon) detergendid). Insuliinianalüüsi vajadus denatureerivates tingimustes on seotud insuliini võimega agregeerida lahuses. Insuliini eraldamiseks HPLC HPLC tingimustes on kirjeldatud ka "traditsioonilise" eluendi äädikhappe kasutamist [152]. Äädikhappe kasutamisel on mitmeid eeliseid - minimaalne mõju eraldatud ühendite natiivsele struktuurile, kättesaadavus, madalad kulud, lisaks on oluline asjaolu, et äädikhape suudab pärssida insuliini seost.

Praegu on HPLC ghvd farmakopöa meetod ainete ja valmis ravimvormide suure molekulmassiga lisandite sisalduse jälgimiseks. Meetodit kasutatakse ka protamiini sisalduse määramiseks isofaan-insuliini preparaatides.

HPLC kasutamine pöördfaasidel (RP HPLC) veiste ja sigade insuliini eraldamiseks esmakordselt näitas selle meetodi kõrget efektiivsust sarnase struktuuriga insuliinitaoliste peptiidide analüüsimisel.

Valkude ja polüpeptiidide eraldamise mehhanism RP HPLC tingimustes põhineb insuliinimolekulide ja nendega seotud lisandite erinevatel hüdrofoobsustel. Praeguseks on kirjeldatud mitmeid kümneid erineva päritoluga insuliini ja nende derivaatide, kaasa arvatud proin-suliini, pankrease polüpeptiide, dezamido derivaate, insuliini dimeeri, kromatograafilise eraldamise meetodeid. [126] näitas võimalust kana, küüliku, lamba ja hobuse insuliini eraldamiseks. Eraldati ka inimese, veiseliha ja sealiha insuliin. Lloyd ja Corran avaldasid meetodi veiseliha, sealiha, iniminsuliinide ja nende vastavate deamideeritud vormide eraldamiseks [104].

Eraldamine viiakse läbi silikageeli sorbentidega modifitseeritud metüül-, butüül-, oktüül-, oktadetsüül- ja fenüülrühmades isokraatlikus või gradientrežiimis. PF-i puhul kasutatakse orgaanilisi modifikaatoreid - atsetonitriili, metüülalkoholi, isopropüülalkoholi, mis on segatud anorgaanilisi sooli ja ioon-auru reaktiive sisaldavate puhverlahustega. Maksimaalne avastamine toimub peamiselt spektrofotomeetrilise meetodiga lainepikkusel 190-220 nm, samuti kirjeldatakse fluoromeetrilisi meetodeid [103].

Aine ja insuliini valmisvormide analüüs RP HPLC abil on kirjeldatud Ameerika ja Euroopa farmakopöa eraviisilistes artiklites [79,150]. Seda meetodit kasutatakse määratletud rühma ravimite testimiseks "insuliini autentsuse", "seotud valkude", "kvantitatiivse määramise" ja "lahuse lahuses" tähenduses.

Teaduskirjanduses kirjeldatakse ka ioonvahetuse ja afiinsuskromatograafia kasutamist insuliini analüüsiks [44,102], kuid neid meetodeid ei ole farmakopöa praktikas laialdaselt kasutatud.

Protamiini kromatograafilise määramise tingimuste valik isofaan-insuliini annusvormides

PF ioonse tugevuse suurenemine põhjustab tavaliselt insuliinivõimsuse suurenemise, mis võib olla tingitud paljudest teguritest: - ioonikontsentratsiooni suurendamine vähendab valgumolekuli laetud rühmade ionisatsiooni astet, suurendades selle hüdrofoobsust / - katioonide suur kontsentratsioon aitab vabade silanoolrühmade sõelumist statsionaarsel pinnal faas, mis nõrgendab valgu protoonitud aminorühmade mittespetsiifilist elektrostaatilist koostoimet maatriksiga; - kõrge ioontugevus mõjutab insuliini ruumilist struktuuri, mille tulemusena muutub sorbendi interaktsioonile kättesaadav pind. Anorgaaniliste soolade kontsentratsioon FS-is mõjutab piikide kuju ja insuliini ja desamido-Asn-insuliini eraldamise selektiivsust [143,144]. Isokraatliku elueerimise teel LiChrosorb Сів sorbendil 0,1 M naatriumfosfaadi lahusega (pH 2,3) saavutati rahuldav tulemus ainult siis, kui puhverlahusele lisati naatriumsulfaat kontsentratsioonini 0,1 M. Enamik insuliinianalüüsi meetodeid, mis sisalduvad farmakopöaartiklites ja ND-s kasutage PF puhvri lahuste alusel, mille naatriumsulfaadi sisaldus on 0,2 M. Selline kõrge naatriumsulfaadi sisaldus mõjutab negatiivselt kromatograafia tulemuste reprodutseeritavust eluentide kihistumise tõttu, väga kontsentreeritud soolalahused avaldavad kromatograafilisele seadmele negatiivset mõju, lühendades selle kasutusiga. Arvestades, et farmakopöa analüüsimeetodid töötati välja rohkem kui 20 aastat tagasi, tundus huvitav uurida insuliini kromatograafilist käitumist OF-HPLC-ga viimase põlvkonna kromatograafilistel sorbentidel, sõltuvalt naatriumsulfaadi kontsentratsioonist. Samal ajal püüdsid nad välja selgitada, kas naatriumsulfaadi sisalduse vähenemine PF-is on lubatud ilma kromatograafilise süsteemi eraldusvõime olulise halvenemiseta. Uuringu tulemusena leiti, et naatriumsulfaadi kontsentratsiooni mõju PF-is on erinev, sõltuvalt siirdatud faasi tüübist, samuti insuliiniliigist. Sorbentidel poogitud rühmadega C4 ja C inimese insuliini ja desamido-Asn-inimese insuliini piikide eraldamise selektiivsus ei sõltu naatriumsulfaadi kontsentratsioonist. puhverlahus vahemikus 0,05 kuni 0,2 M. Diaspher-110-C18 sorbendil on selle paari paari eraldamise selektiivsus maksimaalselt 0,05 M ja minimaalne 0,1 M juures (diagramm 4). Teisest küljest ei sõltu insuliini loomaliikide ja nende vastavate desamiinitud AsnA21 vormide eraldamise selektiivsus lahuse ioontugevusest, kui see eraldatakse Diaspher-110-C18 sorbendil. C8-siirdatud rühmadega sorbendil suureneb selektiivsus 1,25-lt 1,28-ni naatriumsulfaadi kontsentratsiooni suurenemisega (joonis 4). C4-ga poogitud rühmade sorbendil on veiselihasisese insuliini puhul eraldamise selektiivsus maksimaalne 0,1 M naatriumsulfaadi puhul ja minimaalne 0,2 M juures. Sealihasisese insuliini puhul ei ole 0,1 M naatriumsulfaadi kontsentratsioonis väljendunud maksimaalset maksimaalset kontsentratsiooni, antud juhul ioonhappe suurenemist. jõud põhjustasid eraldamise selektiivsuse vähenemist (joonis 4). Tõhusate teoreetiliste plaatide arv suureneb naatriumsulfaadi kontsentratsiooni suurenemisel. Erandiks on iniminsuliini käitumine sorbendil Diasfer-110-C8 (joonis 5). Insuliini ja desamido-Asn-insuliini piikide eraldumise aste suureneb FS ioonse tugevuse suurenemisega, sõltumata insuliiniliigist ja poogitud faasi tüübist (skeem b). Naatriumsulfaadi kontsentratsiooni 0,2 M kuni 0,1 M redutseerimisel väheneb valitud piikide paari eraldusaste inimese ja sea insuliini puhul keskmiselt 5% ja veiseliha insuliini puhul 10%. Arvestades asjaolu, et eraldatuse astme absoluutväärtus ületab 2,0, ei ole kolonni eraldusvõime mõõdetud halvenemine meie arvates oluline. Seega võib naatriumsulfaadi kontsentratsiooni puhverlahuses PF vähendada 2 korda võrreldes farmakopöa analüüsimeetoditega.

Enamikes uuringutes valkude ja peptiidide analüüsi kohta viiakse eraldamine läbi toatemperatuuril. Lisaks näitavad mõned autorid, et temperatuuri mõju eraldamise selektiivsusele on minimaalne [48]. Siiski, kui temperatuur tõuseb, kiireneb statsionaarsete ja liikuvate faaside vaheline massivahetus, mis viib peptiidide retentsiooniaja vähenemiseni ja piikide kitsenemisele.

Insuliin on standardiseeritud

Pankreas on üks tähtsamaid organeid, mis on sisemine ja välimine.
Sisemise sekretsiooni produktiks on insuliin, mis mängib olulist rolli süsivesikute ainevahetuses. Insuliin on spetsiaalsete rakkude toode, mis on koondatud Langerhansi nn saartesse.

Väline saladus on pankrease mahl, mis sisaldab trüpsiini - üks tähtsamaid seedetrakti ensüüme, mida eritavad kõhunäärme põhimassi moodustavad näärmed. Trüpsiin on pankreatiini preparaadi peamine osa.
Insuliin (Insulinum). Insuliin isoleeriti puhtal kujul 1921. aastal. Selle valmistamiseks on palju meetodeid, need erinevad üksteisest enamasti ainult detailselt.

Tulenevalt asjaolust, et lisaks insuliinile sisaldub pankreases ensüüm trüpsiin, mis purustab insuliini üsna kergesti, esimesed katsed saada insuliini kõhunäärmest ebaõnnestusid. Seetõttu püüdsime seda saada näärmest, kus see ensüüm puudub, näiteks kalade või emakasiseste vasikate näärmetest. Kuid isegi sellised katsed tootmise edukusega ei olnud, sest kalades on näärme suurus väga väike ja näärme eritumine on tehniliselt keeruline; suurte koguste emakasisene vasikate ekstraheerimine emakasisesest vasikast tekitab märkimisväärseid raskusi.
Lõpuks näitasid 1922. aastal küpsete veiste nääre katsed, et hapestatud tugeva alkoholi kasutamisel on ensüümid (trüpsiin jne) inaktiveeritud ja kaotavad võime insuliini hävitada.

Tootmise tehnoloogiline skeem. Insuliini tootmiseks kasutatakse külmutatud või värsket kõhunääret peamiselt veistest ja sigadest.
Purustamine. Selleks, et vältida hormooni hävitamist trüpsiiniga, tuleb värsked näärmed mitte hiljem kui 30 minuti jooksul pärast looma tapmist puhastada külgnevatest kudedest, purustada hakklihamasinas.

Ekstraheerimine Purustatud näärmed valatakse 95% alkoholiga, hapestatakse väävelhappega (1 osa näärmest on 1,5 osa 95 ° alkoholist ilma aldehüüdideta + 0,5% väävelhapet või vesinikkloriidhapet). Segu ekstraheeritakse pidevalt segades 1,5 tundi jahutades.
Esimene ekstrakt nõrutatakse, jääk väänatakse välja või tsentrifuugitakse. Ekstraheerimine ekstraheeritakse uuesti 1 tund 60 ° alkoholiga (ja mitte 95 °, kuna tooraines ei ole niiskust) - üks osa näärest võtab ühe osa alkoholi. Mõlemad ekstraktid tühjendatakse kokku ja filtreeritakse läbi lehe.

Liiteseadiste valkude eemaldamine. Saadud ekstraktist eemaldatakse valgud mitmel viisil:
1) settides külma (-4 kuni 0 ° С) 48 tunni jooksul.
2) lisage ekstraktile naatriumhüdroksiidi lahus pH väärtusele 6,6 - 6,8 (mõnel juhul kuni pH = 6,4 - 6,6).

Sade eraldatakse tsentrifuugimise, filtreerimise või settimise abil.
Aurustamine ja rasvaärastus. Saadud selge vedelik hapestatakse puhta väävelhappega pH väärtuseni 2,5 ja aurustatakse 1/10 mahuni temperatuuril, mis ei ületa 40 ° C.
Pärast kogu alkoholi eemaldamist rasvatatakse vedelik.

Soolamine ja puhastamine. Rasvatustatud filtraadile lisatakse küllastunud ammooniumsulfaat, mille järel tekib väike kogus ballastainetega insuliini, moodustades toorainekoori, mis eemaldatakse ja kuivatatakse ning seejärel rasvatatakse alkohol-eetri seguga.
Rasvavaba insuliin kuivatatakse ümbritseva keskkonna tingimustes ja jahvatatakse pulbriks. Puhastamise pulbrid puhastatakse täiendavalt kristallilise insuliini saamiseks, mis sisaldab vähemalt 22 U 1 mg-s.
Standardimine. Saadud insuliin on valge või kergelt hallikas pulber. See lahustub vees ja alkoholi vesilahuses kuni 80 °, kuid ei lahustu alkoholis, mille kindlus on üle 90 °. Kui insuliin lahustatakse vees, saadakse värvitu või kergelt kollakas vedelik.

Säilitamiseks lisatakse lahusele 0,3% trikresooli või fenooli ja allutatakse bioloogilisele standardimisele. Kui insuliini süstitakse küülikutesse, peaks nende süsivesikute sisaldus veres 1,5–5 tunni jooksul vähenema keskmiselt 50%, st 0,09% -lt 0,045% -ni (vt farmakopöa, 9. väljaanne). Vastavat annust nimetatakse üheks küülikuühikuks, mis on võrdne kolme inimese või kolme kliinilise.
Pakend Lahus viiakse läbi bakterifiltri. Seejärel valatakse filtraat aseptilisse seadistusse 5 või 10 ml pudelitesse igas milliliitris insuliinilahuses, mis peaks sisaldama 40 või 80 U.

Viaalid on suletud kummist korgiga, mis on valtsitud alumiiniumist korkidega.
Pudelitele ja karbile pannakse märgised, millele tuleb märkida ettevalmistustegevus, valmistamiskuupäev, kõlblikkusaeg jne.

Enne insuliini kasutamist avatakse alumiiniumkate, pühkitakse alkoholiga, siis korgitakse steriilse nõelaga kork ja nõutav kogus vedelikku imetakse süstlasse, mis süstitakse subkutaanselt või intramuskulaarselt.
Ladustamine Insuliini hoitakse viaalides. Kõlblikkusaeg on 18 kuud temperatuuril, mis ei ületa 10 ° C, kuna kõrgemal temperatuuril võib insuliin osaliselt kaotada.

Ebasobivuse välised tunnused: lahuse või sadestumise hägusus, vormi välimus mikroorganismide viaalides või kolooniates.

Farmakoloogiline rühm - insuliinid

Alarühma ettevalmistused on välistatud. Luba

Kirjeldus

Insuliin (ladina keeles. Insula-saar) on valk-peptiidhormoon, mida toodavad Langerhani pankrease saarekeste β-rakud. Füsioloogilistes tingimustes moodustub β-rakkude insuliin preproinsuliinist, ühe ahelaga prekursorvalgust, mis koosneb 110 aminohappejäägist. Pärast seda, kui kare endoplasmaatiline retiikulum kantakse läbi membraani, lõhustatakse 24 aminohappe signaalpeptiid preproinsuliinist ja moodustub proinsuliin. Golgi seadmes olev proinsuliini pikk ahel on pakendatud graanulitesse, kus hüdrolüüsi tulemusena eraldatakse neli peamist aminohappejääki insuliini ja C-terminaalse peptiidi moodustamiseks (C-peptiidi füsioloogiline funktsioon on teadmata).

Insuliini molekul koosneb kahest polüpeptiidahelast. Üks neist sisaldab 21 aminohappejääki (ahel A), teist - 30 aminohappejääki (ahel B). Ketid on ühendatud kahe disulfiidsilda abil. Kolmas disulfiidsild moodustub ahela A sees. Insuliinimolekuli molekulmass on umbes 5700. Insuliini aminohappejärjestust peetakse konservatiivseks. Enamikul liikidel on üks insuliinigeen, mis kodeerib ühte valku. Erandiks on rotid ja hiired (neil on kaks insuliini geeni), nad toodavad kahte insuliini, mis erinevad B-ahela kahest aminohappejäägist.

Insuliini esmane struktuur mitmesugustes bioloogilistes liikides, sh. erinevates imetajates. Iniminsuliini struktuurile kõige lähemal on seainsuliin, mis erineb inimese poolest aminohappega (aminohappe jäägi asemel treoniini asemel on see B-ahela alaniinijäägiga). Veiste insuliin erineb inimese kolmest aminohappejäägist.

Ajalooline taust. 1921. aastal ekstraheeriti Toronto ülikoolis John J. R. McLeodi laboris töötavad Frederick G. Banting ja Charles G. Best välja pankrease ekstrakt (nagu hiljem osutus amorfseks insuliiniks), mis vähendas koertel veresuhkru taset. eksperimentaalse diabeediga. 1922. aastal süstiti esimese patsiendi, 14-aastase Leonard Thompsoni, kellel oli diabeet, pankrease ekstrakt, mis päästis tema elu. 1923. aastal töötas James B. Collip välja kõhunäärmest ekstraheeritud ekstrakti puhastamise meetodi, mis võimaldas hiljem valmistada sigade ja veiste kõhunäärmetest aktiivseid ekstrakte, mis annavad reprodutseeritavad tulemused. 1923. aastal anti Bantingile ja McLeodile Nobeli füsioloogia ja meditsiini preemia insuliini avastamise eest. 1926. aastal said J. Abel ja V. Du-Vigno insuliini kristallilisel kujul. 1939. aastal kiitis insuliini esmalt heaks FDA (Food and Drug Administration). Frederick Sanger dekodeeris täielikult insuliini aminohappejärjestuse (1949–1954), 1958. aastal anti Sangerile auhind Nobeli preemia eest valkude, eriti insuliini struktuuri dešifreerimisel. 1963. aastal sünteesiti kunstlik insuliin. FDA kiitis esimese rekombinantse iniminsuliini heaks 1982. aastal. FDA kiitis 1996. aastal heaks analoogi ultraheli toimiva insuliiniga (lisproinsuliin).

Toimemehhanism. Insuliini mõju rakendamisel mängib juhtivat rolli selle interaktsioon spetsiifiliste retseptoritega, mis paiknevad raku plasmamembraanil, ja insuliiniretseptori kompleksi moodustumine. Kombinatsioonis insuliiniretseptoriga siseneb insuliin rakku, kus see mõjutab rakuvalkude fosforüülimist ja vallandab mitmeid rakusiseseid reaktsioone.

Imetajatel leidub peaaegu kõigis rakkudes insuliiniretseptoreid nii klassikalistel insuliini sihtrakkudel (hepatotsüütidel, müotsüütidel, lipotsüütidel) kui ka vererakkudel, aju- ja suguelunditel. Erinevate rakkude retseptorite arv on 40 (erütrotsüütid) kuni 300 tuhat (hepatotsüüdid ja lipotsüüdid). Insuliiniretseptor sünteesitakse pidevalt ja laguneb, selle poolestusaeg on 7-12 tundi.

Insuliiniretseptor on suur transmembraanne glükoproteiin, mis koosneb kahest a-subühikust molekulmassiga 135 kDa (igaüks sisaldab 719 või 731 aminohappejääki sõltuvalt mRNA splaissimisest) ja kahest β-subühikust molekulmassiga 95 kDa (620 aminohappejääki). Subühikud on omavahel ühendatud disulfiidsidemetega ja moodustavad heterotetrameerilise struktuuri β-a-α-β. Alfaühikud paiknevad rakuväliselt ja sisaldavad insuliini siduvaid saite, mis on retseptori äratundmise osa. Beetaüksused moodustavad transmembraanse domeeni, omavad türosiinkinaasi aktiivsust ja täidavad signaali konversiooni funktsiooni. Insuliini seondumine insuliiniretseptori a-subühikuga põhjustab β-subühikute türosiinkinaasi aktiivsuse stimuleerimist oma türosiinijääkide autofosforüülimise teel, a, P-heterodimeeride agregatsioon ja hormoon-retseptorite komplekside kiire internaliseerumine. Aktiveeritud insuliiniretseptor alustab biokeemiliste reaktsioonide kaskaadi, sh. teiste rakkude fosforüülimine. Esimene neist reaktsioonidest on nelja valgu, nimelt insuliiniretseptori substraadi (insuliiniretseptori substraat), IRS-1, IRS-2, IRS-3 ja IRS-4 fosforüülimine.

Insuliini farmakoloogilised toimed. Insuliin mõjutab peaaegu kõiki elundeid ja kudesid. Siiski on selle peamised sihtmärgid maks, lihas ja rasvkoes.

Endogeenne insuliin on süsivesikute metabolismi kõige olulisem regulaator, eksogeenne insuliin on spetsiifiline suhkrut vähendav aine. Insuliini mõju süsivesikute metabolismile on tingitud asjaolust, et see suurendab glükoosi transporti läbi rakumembraani ja selle kasutamist kudedes, aitab kaasa glükoosi muundumisele glükogeeniks maksas. Lisaks inhibeerib insuliin glükoosi endogeenset tootmist, pärssides glükogenolüüsi (glükogeeni lagunemine glükoosiks) ja glükoneogeneesi (glükoosi sünteesimine mitte-süsivesikute allikatest - näiteks aminohapetest, rasvhapetest). Lisaks hüpoglükeemilisele toimele on insuliinil mitmeid muid toimeid.

Insuliini mõju rasva ainevahetusele avaldub lipolüüsi pärssimises, mis viib vabade rasvhapete voolu vähenemiseni vereringesse. Insuliin väldib ketoonkehade moodustumist organismis. Insuliin suurendab rasvhapete sünteesi ja nende järgnevat esterdamist.

Insuliin osaleb valkude metabolismis: see suurendab aminohapete transporti kogu rakumembraanis, stimuleerib peptiidide sünteesi, vähendab valkude tarbimist kudedes ja pärsib aminohapete muundumist ketohapeteks.

Insuliini toimega kaasneb mitmete ensüümide aktiveerimine või pärssimine: glükogeeni süntetaas, püruvaadi dehüdrogenaas, heksokinaas stimuleeritakse, lipaasid (ja rasvkoe lipiidide ja lipoproteiini lipaasi hüdrolüüsimine, mis vähendavad seerumi hägusust pärast rasvaste toiduainete allaneelamist) on inhibeeritud.

Pankrease biosünteesi ja insuliini sekretsiooni füsioloogilises regulatsioonis on glükoosi kontsentratsioon veres oluline: selle sisalduse suurenemisega suureneb insuliini sekretsioon ja väheneb see aeglustudes. Lisaks glükoosile mõjutab insuliini sekretsiooni elektrolüüdid (eriti Ca2 + ioonid), aminohapped (sh leutsiin ja arginiin), glükagoon, somatostatiin.

Farmakokineetika. Insuliinipreparaate süstitakse s / c, intramuskulaarselt või intravenoosselt (manustatakse ainult lühikese toimega insuliinid ja ainult diabeetilise prekoomi ja kooma puhul). Insuliinisuspensioonides ei ole võimalik sisestada. Alates sellest ajast peab insuliini temperatuur olema toatemperatuuril külm insuliin imendub aeglasemalt. Kliinilises praktikas on optimaalne viis insuliinravi pidevaks kasutamiseks.

Imendumise täielikkus ja insuliini toime algus sõltuvad süstekohast (tavaliselt süstitakse insuliini kõhu, reide, tuharate, õlavarre), annusesse (süstitud insuliini maht), insuliini kontsentratsioon preparaadis jne.

Insuliini imendumise kiirus süstekohast sõltub mitmetest teguritest, nagu insuliin, süstekoht, lokaalne vere voolukiirus, lokaalne lihasaktiivsus, süstitud insuliini kogus (mitte rohkem kui 12–16 U ravimit soovitatakse süstida ühte kohta). Kõige kiiremini siseneb insuliin eesmise kõhu seina nahaalusest koest veres, aeglasemalt õlast, reie esipinnast ja isegi aeglasemalt subcapularis'est ja tuharadest. See on tingitud loetletud piirkondade nahaaluse rasvkoe vaskularisatsiooni astmest. Insuliini tegevusprofiil sõltub märkimisväärselt kõikidest inimestest ja samast isikust.

Veres seondub insuliin alfa- ja beeta-globuliinidega, tavaliselt 5–25%, kuid seerumi antikehade ilmnemise tõttu võib seondumine suureneda ravi ajal (eksogeense insuliini vastaste antikehade teke põhjustab insuliiniresistentsust; tänapäevaste kõrgelt puhastatud preparaatide kasutamisel esineb insuliiniresistentsus harva ). T1/2 vähem kui 10 min. Enamik vereringesse vabanenud insuliini läbib maksa ja neerude proteolüütilise lagunemise. See eritub kiiresti neerude kaudu (60%) ja maksas (40%); vähem kui 1,5% eritub uriiniga muutumatul kujul.

Praegu kasutatavad insuliinipreparaadid erinevad mitmel viisil, sealhulgas päritolu allika, toime kestuse, lahuse pH (happeline ja neutraalne), säilitusainete (fenool, kresool, fenoolkresool, metüülparabeen), insuliinikontsentratsiooni - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml juuresolekul.

Klassifikatsioon. Insuliinid klassifitseeritakse tavaliselt päritolu järgi (veised, sea, inimene, iniminsuliini analoogid) ja toime kestus.

Sõltuvalt tootmisallikatest eristatakse loomset päritolu insuliini (peamiselt sealihasiseseid preparaate), poolsünteetilisi iniminsuliinipreparaate (saadud sealihas insuliinist ensümaatilise transformatsiooni teel), inim-insuliini preparaate (geenitehnoloogia abil toodetud DNA-rekombinants).

Meditsiinilisel otstarbel saadi insuliin varem peamiselt veiste kõhunäärmest, seejärel sigade kõhunäärmetest, arvestades, et seainsuliin on iniminsuliinile lähemal. Kuna veiste insuliin, mis erineb inimese kolmest aminohappest, põhjustab sageli allergilisi reaktsioone, siis täna seda praktiliselt ei kasutata. Sigade insuliin, mis erineb inimese ühest aminohappest, põhjustab vähem tõenäoliselt allergilisi reaktsioone. Insuliinravimites, kui puhastamine on ebapiisav, võib esineda lisandeid (proinsuliin, glükagoon, somatostatiin, valgud, polüpeptiidid), mis võivad põhjustada erinevaid kõrvalreaktsioone. Kaasaegsed tehnoloogiad võimaldavad puhastada (monopiirkromatograafiliselt puhastada insuliini "piigi" vabanemisega), väga puhastatud (monokomponentne) ja kristalliseeritud insuliinipreparaadid. Loomset insuliini sisaldavatest preparaatidest eelistatakse sigade kõhunäärmest saadud monopiikki insuliini. Geenitehnoloogia abil saadud insuliin on täielikult kooskõlas iniminsuliini aminohappelise koostisega.

Insuliini aktiivsus määratakse bioloogilise meetodiga (vastavalt selle võimele alandada veresuhkru taset küülikutel) või füüsikalis-keemilise meetodiga (elektroforeesil paberil või kromatograafia abil paberil). Ühe toimemooduli või rahvusvahelise üksuse aktiivsus on 0,04082 mg kristalset insuliini. Inimese kõhunäärmes on kuni 8 mg insuliini (ligikaudu 200 U).

Insuliinipreparaadid jagunevad lühi- ja ultraheliravimiteks - imiteerivad insuliini normaalset füsioloogilist eritumist kõhunäärmes vastuseks stimulatsioonile, keskmise kestusega ravimeid ja pikatoimelisi ravimeid - imiteerivad nii basaalset (tausta) insuliini sekretsiooni kui ka kombineeritud ravimeid (kombineerige mõlemad toimingud).

On järgmised grupid:

Ultrashort-toimelised insuliinid (hüpoglükeemiline efekt tekib 10–20 minutit pärast s / c süstimist, toime tipp on saavutatud keskmiselt 1-3 tunni pärast, toime kestus on 3-5 tundi)

- lisproinsuliin (Humalog);

- aspartinsuliin (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- glulisiiniinsuliin (apidra).

Lühitoimelised insuliinid (toime algus tavaliselt 30–60 minuti pärast; maksimaalne toime 2… 4 tunni pärast; toime kestus 6… 8 tundi):

- lahustuv insuliin [inimese geenitehnoloogia] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Regular);

- lahustuv insuliin [inimese poolsünteetiline] (Biogulin R, Humodar R);

- lahustuv insuliin [sea monokomponent] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Pikatoimelised insuliinipreparaadid - hõlmavad ravimeid, mille kestus on keskmine ja pikatoimelised.

Keskmise toimeajaga insuliinid (algavad 1,5–2 h pärast, tipp 3–12 tunni pärast; kestus 8–12 h):

- Insuliinisofaan [inimese geenitehnoloogia] (biosuliin N, Gansuliin N, Gensuliin N, Insuman Bazal GT, Insuran NPH, Protafan NM, Rinsuliin NPH, Humulin NPH);

- insuliinisofaan [inimese poolsünteetiline] (Bioguliin N, Humodar B);

- insuliin-isofaan [sea monokomponent] (Monodar B, Protafan MS);

- tsinkühendi insuliini suspensioon (Monotard MS).

Pikatoimelised insuliinid (algavad pärast 4... 8 tundi; piik 8–18 tunni pärast; kogukestus 20–30 h):

- glargiininsuliin (Lantus);

- detemirinsuliin (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Kombineeritud insuliinipreparaadid (kahefaasilised preparaadid) (hüpoglükeemiline toime algab 30 minutit pärast s / c manustamist, jõuab maksimaalselt 2... 8 tunni pärast ja kestab kuni 18–20 tundi):

- bifaasiline insuliin [inimese poolsünteetiline] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- bifaasiline insuliin [inimese geneetiliselt muundatud] (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- aspartinsuliini bifaasiline (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Ultrashort-toimelised insuliinid on inimese insuliini analoogid. On teada, et kõhunäärme β-rakkudes olev endogeenne insuliin, samuti lühikese toimeajaga insuliini toodetud hormoonimolekulid polümeriseeritakse ja on heksameerid. Kui s / c manustamine heksameersed vormid imenduvad aeglaselt ja hormooni tippkontsentratsioon veres on sarnane tervele inimesele pärast söömist, on võimatu luua. Esimene lühitoimeline insuliini analoog, mis imendub nahaalusest koest 3 korda kiiremini kui iniminsuliin, oli lisproinsuliin. Insuliin lispro on iniminsuliini derivaat, mis saadakse insuliinimolekulis kahe aminohappejäägi (lüsiin ja proliin B-ahela positsioonides 28 ja 29) vahetamisega. Insuliinimolekuli modifitseerimine katkestab heksameeride moodustumise ja tagab ravimi kiire voolu verre. Peaaegu vahetult pärast s / c süstimist kudedesse lagunevad lisproinsuliinimolekulid heksameeridena kiiresti monomeeridena ja sisenevad vere. Teine insuliini analoog - aspartinsuliin - loodi asendades positsioonis B28 oleva proliini negatiivselt laetud asparagiinhappega. Sarnaselt insuliin lisproga laguneb see pärast süstimist kiiresti ka monomeeridena. Glulisiininsuliini puhul aitab aminohappe asparagiinse iniminsuliini asendamine lüsiini ja lüsiini positsioonis B3 glutamiinhappe asendis B29 kaasa ka kiiremale imendumisele. Ultrashort-toimega insuliini analooge võib manustada vahetult enne sööki või pärast sööki.

Lühitoimelised insuliinid (nimetatakse ka lahustuvateks) on lahused neutraalse pH väärtusega puhvris (6,6–8,0). Need on ette nähtud subkutaanseks, harvemini intramuskulaarseks manustamiseks. Vajadusel manustatakse neid ka intravenoosselt. Neil on kiire ja suhteliselt lühike hüpoglükeemiline toime. Mõju pärast subkutaanset süstimist toimub 15–20 min pärast, saavutab maksimaalse 2 tunni pärast; toime kestus on ligikaudu 6 tundi, neid kasutatakse peamiselt haiglas patsiendile vajaliku insuliiniannuse kindlaksmääramisel ja ka siis, kui on vaja kiiret (kiiret) toimet - diabeetilise kooma ja precoma puhul. Mis on / sissejuhatuses T1/2 on 5 minutit, mistõttu manustatakse diabeetilise ketoatsidootilise kooma puhul insuliini tilguti. Lühiajalise toimega insuliinipreparaate kasutatakse ka anaboolseteks aineteks ning need on reeglina ette nähtud väikestes annustes (4-8 RÜ 1–2 korda päevas).

Keskmise toimeajaga insuliinid on vähem lahustuvad, nad on aeglasemalt imenduvad nahaalusest koest, mistõttu neil on pikem toime. Nende ravimite pikaajaline toime saavutatakse spetsiaalse pikendaja - protamiini (isofaan, protapaan, basaal) või tsingi juuresolekul. Tsinkkristallide olemasolu tõttu insuliini tsinkühendi suspensiooni sisaldavate preparaatide insuliini imendumise aeglustumine. NPH-insuliin (neutraalne protamiin Hagedorn või isofaan) on suspensioon, mis koosneb insuliinist ja protamiinist (protamiin on kalapiimast eraldatud valk) stöhhiomeetrilise suhtega.

Pikaajalise toimega insuliinid hõlmavad glargiininsuliini - inimese insuliini analoogi, mis on saadud DNA rekombinantse tehnoloogia abil - esimene insuliinravim, millel ei ole märkimisväärset toimet. Insuliinglargiin saadakse insuliinimolekulis kahe modifikatsiooniga: asendades A-ahela (asparagiin) glütsiiniga positsioonis 21 ja kinnitades kaks arginiinijääki B-ahela C-otsa. Ravim on selge lahus, mille pH on 4. Happeline pH stabiliseerib insuliinheksameere ja tagab pika ja prognoositava ravimi imendumise nahaalusest koest. Kuid happelise pH tõttu ei saa glargiini insuliini kombineerida neutraalse pH-ga lühiajaliste insuliinidega. Glargiininsuliini ühekordne süstimine tagab 24-tunnise mitte-piigi glükeemilise kontrolli. Enamikul insuliinipreparaatidest on nn. "Peak" toime täheldati, kui insuliini kontsentratsioon veres jõuab maksimaalselt. Glargiini insuliinil ei ole väljendunud piiki, kuna see vabaneb vereringesse suhteliselt püsiva kiirusega.

Pikaajalise toimega insuliinipreparaadid on saadaval mitmesugustes ravimvormides, millel on erineva kestusega hüpoglükeemiline toime (10 kuni 36 tundi). Pikaajaline toime vähendab igapäevaste süstide arvu. Need valmistatakse tavaliselt suspensioonide kujul, mida manustatakse ainult subkutaanselt või intramuskulaarselt. Diabeetilises koomas ja comatoseelses seisundis ei kasutata pikaajalisi ravimeid.

Kombineeritud insuliinipreparaadid on suspensioonid, mis koosnevad neutraalsest lahustuvast lühitoimelisest insuliinist ja insuliinisofaanist (keskmine toime kestus) teatud suhetes. See kombinatsioon erinevate preparaatide kestusega ühest preparaadist võimaldab patsiendil säästa kahte süstet eraldi ravimite kasutamisega.

Näidustused. Insuliini kasutamise põhinäitajaks on 1. tüüpi suhkurtõbi, kuid teatud tingimustel on see ette nähtud ka 2. tüüpi suhkurtõve, sh. resistentsus suukaudsete hüpoglükeemiliste toimeainetega, raskete kaasnevate haigustega, kirurgilise sekkumise ettevalmistamine, diabeetiline kooma, diabeet rasedatel naistel. Lühiajalist insuliini kasutatakse mitte ainult suhkurtõve korral, vaid ka mõnel muul patoloogilisel protsessil, näiteks üldiselt (anaboolse toimeainena), furunkuloosina, türeotoksikoosina, mao (atoonia, gastroptoosi), kroonilise hepatiidi ja maksa tsirroosi esmaste vormide korral. samuti mõnedes vaimsetes haigustes (suurte insuliiniannuste manustamine - nn hüpoglükeemiline kooma); seda kasutatakse mõnikord akuutse südamepuudulikkuse raviks kasutatavate „polariseerivate” lahuste osana.

Insuliin on diabeedi peamine spetsiifiline ravi. Suhkurtõve ravi toimub vastavalt spetsiaalselt välja töötatud skeemidele, millel on erineva kestusega insuliinipreparaadid. Ravimi valik sõltub haiguse kulgemise raskusest ja omadustest, patsiendi üldseisundist ja ravimi suhkrut alandava toime alguse kiirusest ja kestusest.

Kõiki insuliinipreparaate kasutatakse tingimusel, et toitumisrežiim vastab kohustuslikult toidu energia väärtusele (1700 kuni 3000 kcal).

Insuliini annuse määramisel juhinduvad nad glükoosi ja paastumise tasemest päeva jooksul ning glükosuuria tasemest päeva jooksul. Lõplik annuse valik toimub hüperglükeemia, glükosuuria ja patsiendi üldseisundi vähendamise kontrolli all.

Vastunäidustused. Insuliin on vastunäidustatud hüpoglükeemiaga (nt insuliini) esinevate haiguste ja seisundite korral, ägedate maksahaiguste, kõhunäärme, neerude, mao- ja kaksteistsõrmiksoole haavandite, dekompenseeritud südamepuudulikkuse, ägeda koronaarse puudulikkuse ja mõne muu haiguse korral.

Kasutamine raseduse ajal. Diabeedi peamiseks raviks raseduse ajal on insuliinravi, mis toimub hoolika järelevalve all. 1. tüüpi suhkurtõve korral jätkatakse insuliinravi. 2. tüüpi suhkurtõve korral tühistatakse suukaudsed hüpoglükeemilised ravimid ja viiakse läbi dieetravi.

Raseduse diabeet (rasedad diabeedid) on süsivesikute ainevahetuse häire, mis esines raseduse ajal. Gestatsiooniline suhkurtõbi on seotud suurenenud riskiga perinataalse suremuse tekkeks, kaasasündinud väärarengute esinemissagedusele ja diabeedi progresseerumise riskile 5–10 aastat pärast manustamist. Raseduse diabeedi ravi algab dieediga. Kui dieedi ravi on ebaefektiivne, kasutatakse insuliini.

Varem olemasoleva või gestatsiooniga suhkurtõvega patsientidel on oluline säilitada metaboolsete protsesside adekvaatne reguleerimine raseduse ajal. Vajadus insuliini järele võib raseduse esimesel trimestril väheneda ja suureneda teisel ja kolmandal trimestril. Sünnituse ajal ja vahetult pärast seda võib insuliinivajadus oluliselt väheneda (hüpoglükeemia oht suureneb). Nendel tingimustel on oluline vere glükoosisisalduse hoolikas jälgimine.

Insuliin ei tungi platsentaarbarjääri. Kuid ema IgG antikehad insuliini suhtes läbivad platsenta ja võivad põhjustada lootele hüperglükeemiat, neutraliseerides sellest insuliini. Teisest küljest võib insuliin-antikeha komplekside soovimatu dissotsiatsioon põhjustada hüperinsulinemiat ja hüpoglükeemiat lootele või vastsündinule. Näidati, et veise / sigade insuliinipreparaatidest üleminek ühekomponendilistele preparaatidele kaasneb antikeha tiitri vähenemisega. Sellega seoses on soovitatav raseduse ajal kasutada ainult iniminsuliini preparaate.

Insuliinianaloogid (nagu teised uued ravimid) määratakse raseduse ajal ettevaatusega, kuigi puuduvad usaldusväärsed tõendid kõrvaltoimete kohta. Vastavalt FDA (Food and Drug Administration) üldtunnustatud soovitustele, mis määravad kindlaks raseduse ajal narkootikumide kasutamise võimaluse, kuuluvad lootele toime saamiseks insuliinipreparaadid B-kategooriasse (loomade paljunemise uuring ei näidanud kahjulikku mõju lootele ning piisavad ja rangelt kontrollitud uuringud rasedatel naistel) ei ole läbi viidud) või C-kategooriasse (loomade reproduktsiooniuuringud näitasid lootele kahjulikku toimet ning ei ole läbi viidud piisavaid ja hästi kontrollitud uuringuid rasedatel naistel, kuid potentsiaalset kasu, mis on seotud uimastite kasutamisega rasedatel naistel, võib selle võimaliku ohu tõttu õigustada. Seega kuulub insuliin lizpro B-klassi ja aspartinsuliin ja glargiininsuliin - C-klassi.

Insuliinravi komplikatsioonid. Hüpoglükeemia. Liiga suurte annuste sissetoomine, samuti süsivesikute tarbimise puudumine koos toiduga võib põhjustada soovimatu hüpoglükeemilise seisundi, hüpoglükeemiline kooma võib tekkida teadvuse kaotuse, krampide ja südametegevuse depressiooni korral. Hüpoglükeemia võib tekkida ka täiendavate tegurite tõttu, mis suurendavad insuliinitundlikkust (nt neerupealiste puudulikkus, hüpopituitarism) või suurendavad glükoosi imendumist (treening).

Hüpoglükeemia varased sümptomid, mis on suures osas seotud sümpaatilise närvisüsteemi aktiveerimisega (adrenergilised sümptomid), hõlmavad tahhükardiat, külma higi, värisemist, parasümpaatilise süsteemi aktiveerimist - raske nälg, iiveldus ja huulte ja keele kihelus. Hüpoglükeemia esimesel märgil tuleb võtta kiireloomulisi meetmeid: patsient peab juua magusat teed või sööma mõningaid suhkrutükke. Hüpoglükeemilise kooma korral süstitakse veeni 40% glükoosi lahus koguses 20–40 ml, kuni patsient lahkub komaatloomast (tavaliselt mitte üle 100 ml). Hüpoglükeemiat saab eemaldada ka glükagooni intramuskulaarse või subkutaanse manustamise teel.

Kehakaalu suurenemine insuliinravi ajal on seotud glükosuuria kõrvaldamisega, toidu tegeliku kalorisisalduse suurenemisega, isu suurenemisega ja lipogeneesi stimuleerimisega insuliini toimel. Kui järgite toitumispõhimõtteid, saab seda kõrvaltoimet vältida.

Tänapäeva kõrgelt puhastatud hormoonravimite (eriti geneetiliselt muundatud iniminsuliini preparaatide) kasutamine põhjustab suhteliselt harva insuliiniresistentsuse ja allergiate teket, kuid selliseid juhtumeid ei välistata. Ägeda allergilise reaktsiooni tekkimine nõuab kohest desensitiseerivat ravi ja ravimi asendamist. Veiste / sigade insuliinipreparaatide reaktsiooni väljatöötamisel tuleb need asendada iniminsuliinipreparaatidega. Kohalikud ja süsteemsed reaktsioonid (sügelus, lokaalne või süsteemne lööve, subkutaansete sõlmede moodustumine süstekohas) on seotud insuliini ebapiisava puhastamisega lisanditest või veiste või sigade insuliini kasutamisega, mis erinevad inimese aminohappejärjestusest.

Kõige sagedasemad allergilised reaktsioonid on nahk, IgE-vahendatud antikehad. Mõnikord täheldatakse süsteemseid allergilisi reaktsioone, samuti IgG antikehade vahendatud insuliiniresistentsust.

Ähmane nägemine Patsiendi refraktsiooni mööduvad häired tekivad insuliinravi alguses ja kaovad iseseisvalt 2-3 nädala jooksul.

Turse. Esimesel ravinädalal esineb ka mööduvat jalgade turset, mis on tingitud vedelikupeetusest, nn. insuliini turse.

Lokaalsed reaktsioonid hõlmavad lipodüstroofiat korduvate süstide kohas (harva esinev komplikatsioon). Eraldage lipoatroofia (nahaaluse rasva kadumiste kadumine) ja lipohüpertroofia (suurenenud nahaaluse rasva sadestumine). Neil kahel riigil on erinev olemus. Lipoatroofia - immunoloogilist reaktsiooni, mis on peamiselt tingitud halvasti puhastatud loomse päritoluga insuliinipreparaatide manustamisest, ei ole praktiliselt leitud. Lipohüpertroofia areneb koos kõrge puhtusastmega iniminsuliinipreparaatidega ja võib tekkida, kui süstimistehnika on häiritud (külmpreparaat, alkohol muutub naha alla) ja ka preparaadi enda anaboolse toimega. Lipohüpertrofia tekitab kosmeetilise defekti, mis on patsientidele probleemiks. Lisaks on selle defekti tõttu ravimi imendumine vähenenud. Lipohüpertroofia tekke vältimiseks on soovitatav pidevalt muuta samas piirkonnas asuvaid süstekohasid, jättes vähemalt 1 cm kahe torke vahele.

Võib esineda kohalikke reaktsioone, nagu valu manustamiskohas.

Koostoime Insuliini preparaate võib omavahel kombineerida. Paljud ravimid võivad põhjustada hüpo- või hüperglükeemiat või muuta suhkurtõvega patsiendi reaktsiooni ravile. Te peate arvestama interaktsiooni, mis on võimalik insuliini samaaegsel kasutamisel teiste ravimitega. Alfa-blokaatorid ja beeta-adrenomimetikid suurendavad endogeense insuliini sekretsiooni ja suurendavad ravimi toimet. Insuliini hüpoglükeemilist toimet suurendavad suukaudsed hüpoglükeemilised ained, salitsülaadid, MAO inhibiitorid (sealhulgas furasolidoon, prokarbasiin, selegiliin), AKE inhibiitorid, bromokriptiin, oktreotiid, sulfanilamiidid, anaboolsed steroidid (eriti oksandroloon, metandienoon) ja terapeutid ja terapeudid ning abistavad sama ravi ja ravimeetodite ning sulfidide, anaboolsete steroidide ja anaboolsete steroidide abiga. glükagooni, mis põhjustab hüpoglükeemiat, eriti insuliiniresistentsuse korral, võib tekkida vajadus insuliini annuse vähendamiseks), somatostatiini analoogid, guanetidiin, dizo püramiidid, klofibraat, ketokonasool, liitiumpreparaadid, mebendasool, pentamidiin, püridoksiin, propoksüfeen, fenüülbutasoon, fluoksetiin, teofülliin, fenfluramiin, liitiumpreparaadid, kaltsiumi preparaadid, tetratsükliinid. Klorokviin, kinidiin, kiniin vähendab insuliini lagunemist ja võib suurendada insuliini kontsentratsiooni veres ja suurendada hüpoglükeemia riski.

Karboanhüdraasi inhibiitorid (eriti atsetasoolamiid), stimuleerides kõhunäärme β-rakke, soodustavad insuliini vabanemist ja suurendavad retseptorite ja kudede tundlikkust insuliinile; kuigi nende ravimite samaaegne kasutamine insuliiniga võib suurendada hüpoglükeemilist toimet, võib mõju olla ettearvamatu.

Mitmed ravimid põhjustavad tervetel inimestel hüperglükeemiat ja süvendavad diabeedihaigete haiguse kulgu. Insuliini hüpoglükeemiline toime on nõrgenenud: retroviirusevastased ravimid, asparaginaas, suukaudsed hormonaalsed rasestumisvastased vahendid, glükokortikoidid, diureetikumid (tiasiid, etakrünhape), hepariin, H antagonistid2-retseptorid, sulfinpirasoon, tritsüklilised antidepressandid, dobutamiin, isoniasiid, kaltsitoniin, niatsiin, sümpatomimeetikumid, danasool, klonidiin, BKK, diasoksiid, morfiin, fenütoiin, somatotropiin, kilpnäärme hormoonid, fenotiasiini derivaadid, nikotiin, etanool, etanool, fenotoin, somatotropiin, kilpnäärme hormoonid, fenotiasiiniderivaadid, nikotiin, etanool

Glükokortikoididel ja epinefriinil on perifeersetes kudedes vastupidine toime insuliinile. Seega võib süsteemsete glükokortikoidide pikaajaline manustamine põhjustada hüperglükeemiat, kaasa arvatud suhkurtõbi (steroidne diabeet), mis võib esineda ligikaudu 14% patsientidest, kes võtavad süsteemset kortikosteroidi mitu nädalat, või pikaajalise kortikosteroidide kasutamisega. Mõned ravimid inhibeerivad insuliini eritumist otseselt (fenütoiin, klonidiin, diltiaseem) või kaaliumi (diureetikumide) varu vähendamisega. Kilpnäärme hormoonid kiirendavad insuliini metabolismi.

Kõige olulisem ja sageli mõjutab beeta-blokaatorite, suukaudsete hüpoglükeemiliste ainete, glükokortikoidide, etanooli, salitsülaatide toimet.

Etanool inhibeerib glükoneogeneesi maksas. Seda mõju täheldatakse kõikidel inimestel. Sellega seoses tuleb meeles pidada, et alkohoolsete jookide kuritarvitamine insuliinravi taustal võib viia raske hüpoglükeemilise seisundi tekkeni. Väikesed kogused toiduga toidetud alkoholi ei põhjusta tavaliselt probleeme.

Beeta-blokaatorid võivad inhibeerida insuliini sekretsiooni, muuta süsivesikute metabolismi ja suurendada perifeerset resistentsust insuliini suhtes, mis viib hüperglükeemia tekkeni. Siiski võivad nad inhibeerida ka katehhoolamiinide toimet glükoneogeneesile ja glükogenolüüsile, mis on seotud tõsiste hüpoglükeemiliste reaktsioonide riskiga diabeetikutel. Peale selle võivad ükskõik millised beeta-adrenergilised blokaatorid varjata adrenergilisi sümptomeid, mis on põhjustatud veresuhkru taseme langusest (kaasa arvatud treemor, südamepekslemine), häirides seeläbi patsiendi hüpoglükeemia õigeaegset äratundmist. Selektiivne beeta1-adrenergilised blokaatorid (kaasa arvatud acebutolool, atenolool, betaksolool, bisoprolool, metoprolool) avaldavad seda mõju vähemal määral.

MSPVA-d ja suure annusega salitsülaadid inhibeerivad prostaglandiin E sünteesi (mis inhibeerib endogeense insuliini sekretsiooni) ja suurendavad seega insuliini põhilist sekretsiooni, suurendavad kõhunäärme β-rakkude glükoosi tundlikkust; samaaegsel kasutamisel võib hüpoglükeemiline toime vajada MSPVA-de või salitsülaatide ja / või insuliini annuse kohandamist, eriti pikaajalise jagamise korral.

Praegu toodetakse märkimisväärsel hulgal insuliinipreparaate, sh. tulenevad loomade kõhunäärmest ja sünteesitakse geenitehnoloogia abil. Insuliinravi valmistamiseks kasutatavad preparaadid on geneetiliselt muundatud kõrge puhtusastmega inimese insuliinid, millel on minimaalne antigeensus (immunogeenne toime), samuti inimese insuliini analoogid.

Insuliinipreparaate toodetakse klaasviaalides, mis on hermeetiliselt suletud alumiiniumist kummikorgiga, spetsiaalses nn. insuliinisüstlad või süstla pliiatsid. Süstla pensüstelite kasutamisel on preparaadid spetsiaalsetes viaalikassettides (penfill).

Töötatakse välja insuliini intranasaalsed vormid ja suukaudseks manustamiseks mõeldud insuliinipreparaadid. Insuliini kombineerimisel detergendiga ja manustamisega aerosoolina nina limaskestale saavutatakse efektiivne plasmakontsentratsioon nii kiiresti kui IV boolusena manustamisel. Intranasaalset ja suukaudset insuliini valmistatakse või tehakse kliinilisi uuringuid.