Insuliini tootmise tehnoloogia

Analüüsid

Insuliin on üks inimorganismi ise toodetud hormoonidest, eriti kõhunäärmest. Selle aine sekretsiooni rikkumine toob kaasa sellise tõsise haiguse nagu diabeet. Selle raviks sünteetilise hormooni abil, mis pikka aega isoleeriti karjakasvandusest. Kuid insuliini tootmiseks kasutatavat tehnoloogiat väga tavalise bakteri - Escherichia coli või pärmseente abil - on kasutatud juba pikka aega. Selle meetodi kasutamine võimaldab teil vältida allergilisi reaktsioone, mis on põhjustatud võõrastest valkudest, millel on kerge erinevus inimesest.

Tehnoloogiline kava

Insuliini tootmistehnoloogia hõlmab kõiki biotehnoloogia toodete tootmise peamisi etappe. Tulemuseks on kristalne lõpptoode, mida seejärel kasutatakse I ja II tüüpi raske diabeedi raviks kasutatavate süstelahuste valmistamiseks. Selle hormooni peamine toime kehas avaldub veres sisalduva glükoosi taseme languses.

Insuliini tootmise etapid on järgmised:

Esialgne. Ta teostab selliseid toiminguid nagu vee ja õhu ettevalmistamine ja puhastamine, tööstuspindade puhastamine ning seadmete steriliseerimine, personali kontrollimine, käte töötlemine ja steriilsete kingade ja rõivaste väljastamine. Esialgses etapis valmistatakse ka nende molekulaarsete ahelate primaarne keemiline süntees, millest valk on kokku pandud. Kett A sisaldab 21 aminohappejääki ja ahel B sisaldab 30 aminohapet.
Toitelahuste ja rakukultuuri ettevalmistamine. Elava raku valmistamiseks tekib vajalik ühend, sisestatakse vastav geen. Selleks lõigatakse plasmiid spetsiaalsete ensüümide, piirangute ja vajalike ühendite sünteesi kodeerivate geenide külge. Seejärel, kasutades mikroinjektsioonimeetodit, viiakse modifitseeritud plasmiid tagasi rakku.
Rakususpensiooni kasvatamine. Geneetiliselt muundatud rakud paigutatakse toitainelahusesse, millel on kõik kasvuks ja paljunemiseks ning steriliseerimiseks vajalikud koostisosad. Kultuuri kasvatamine toimub erilistes bioreaktorites, kus eelnevalt puhastatud õhku söödetakse. Perioodiliselt lisatakse reaktorisse teatud kogus toitelahust ja samal ajal eemaldatakse sama kogus rakususpensiooni.
Kultuuri jaotamine. Vedeliku ja rakukultuuri eraldamine toimub sedimentatsiooniga (settimine) erilistes setetes ja seejärel filtrimisel, mis võimaldab säilitada rakkude terviklikkust.
Aine kromatograafiline puhastamine. See viiakse läbi sobival seadmel, kasutades erinevaid meetodeid, eriti frontaalset, anioonvahetust ja geeli läbilaskvuskromatograafiat.
Valgu molekuli saamine. Tegelikus biotehnoloogia staadiumis esineb tootmata insuliinimolekuli süntees. Ja selle kettide kaks komponenti. Need on õmmeldud pärast saadud ahelate oksüdeerimist ja voltimist, mille tulemuseks on disulfiidsildade moodustumine.
Külmkuivatamine spetsiaalses ahjus, mille tulemusena kontrollitakse saadud kristallpreparaadi vastavust standardile, pakendatakse, märgistatakse ja saadetakse tarbijale.

Meie ettevõte pakub soodsatel tingimustel valmis tootmisliine, kus on täielikult täidetud kogu insuliinitootmise tehnoloogia. Tänu täpsetele arvutustele, tehnilisele ja informatsioonilisele toetusele ning personali väljaõppele tervikliku programmi raames on ettevõte tulus ja selle tooted on nõudlikud.

Insuliini avastus

Tänapäeval mõjutab diabeet planeedil rohkem kui 400 miljonit inimest, mis on umbes 8% maailma täiskasvanud elanikkonnast. Riigiregistri andmetel kannab Venemaal üle 3,3 miljoni inimese diabeedi (I tüüpi diabeedi all kannatab umbes 300 tuhat inimest ja II tüüpi diabeedi all umbes 3 miljonit inimest). Need arvud ei kajasta tõenäoliselt tegelikku olukorda. Kõik need inimesed, kes elavad iga päev, mõistavad, et nende elu sõltub insuliinist.

Esimesed katsed diabeedi raviks tehti enne meie ajastu. Vana-kreeka ja rooma arstid kasutasid seda massaaži, võimlemist, vanni, aroomiteraapiat ja palju muud. 19. sajandil töötati diabeetikutele ette vähese süsivesikute liha dieet. Esimene katse diabeedi raviks insuliinisüstidega tehti 1921. aastal. Kanada teadlane Frederick Banting sai esimene inimene, kes kasutas diabeedi kontrollimiseks insuliinhormooni. Ta oli ainult 32 koodi, kui ta sai meditsiinis Nobeli preemia. Ta lõi ravimi tõhusalt ja ilma kõrvaltoimeteta vähendas glükoosi taset 28,9-lt 6,7 mmol-le. See ravim andis paljudele lootust elule.

1869. aastal avastas teadlane Paul Langergans kõhunäärmes rakkude rühmi, mis hiljem sai temast nimeks "Langerhani saared". Seejärel eraldati insuliin nende saarekeste rakkudest. Insuliin on hormoon, mis reguleerib metabolismi, peamiselt süsivesikuid (suhkruid), aga ka rasvu ja valke. Diabeedi tõttu insuliini ebapiisava ekspositsiooni tõttu tekib keeruline metaboolne häire, suureneb veresuhkru tase (hüperglükeemia), suhkur eritub uriiniga (glükosuuria) ja verepetoonide kehades (ketoatsidoos) tekivad happelised rasvapõletustooted.

Pärast insuliini avastamist hakkasid paljud teadlased selle ravimi puhastamise meetodeid välja töötama, kuna tegemist on nõrgestatud keha kahjustavate lisanditega.

Agilent Technologies on analüütiliste seadmete ülemaailmne liider. Kromatograafia- ja spektraalanalüüsi vahendid enam kui aasta on aidanud teadlastel üle maailma lahendada ravimite olulisi probleeme. Insuliini puhtuse kontroll ei ole erand. Varem kasutati sel eesmärgil klassikalist vedelikkromatograafiat, saades samas üsna vastuvõetavaid tulemusi:

Pärast paljusid uuringuid tõestasid teadlased, et moodustunud insuliinpolüpeptiid molekulmassiga umbes 6000, tuvastatakse tõhusalt, kasutades viimaseid arenguid tõrjutuskromatograafia valdkonnas.

Selle uue meetodiga on võimalik võrrelda “head insuliini”, mida säilitati soovitatud tingimustes, ja “halva insuliini”. Kui kaks kromatogrammi üksteise peale asetati, selgus, et insuliinipreparaadis, mida hoiti ebasoodsates tingimustes, hävitati sihtmolekul ja selle asemel identifitseeriti lagunemissaadused kromatogrammil.

Insuliinipreparaatide analüüsimise ja standardimise meetodite väljatöötamine ja ühtlustamine pöördfaasilise kõrgsurvevedelikkromatograafia abil (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

See väitekirja peaks lähitulevikus raamatukogu juurde minema.
Teavitage sissepääsust

Töö - 480 rubla., Kohaletoimetamine 10 minutit, ööpäevaringselt, seitse päeva nädalas ja pühad.

Abstraktne - 240 rubla, kohaletoimetamine 1-3 tundi, 10-19 (Moskva aeg), välja arvatud pühapäev

Pihtar Anatoli Vasilyevich. Insuliinipreparaatide analüüsimise ja standardimise meetodite väljatöötamine ja ühtlustamine pöördfaasilise kõrgsurvevedelikkromatograafia (RP HPLC) abil: väitekiri. Farmaatsiateaduste kandidaat: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Kaitse koht: Moskva meditsiiniakadeemia].- Moskva, 2005.- 139 lk.: Il.

Väitekirja sisu

1. PEATÜKK Kirjanduse ülevaade 11

1. Insuliini roll suhkurtõve ravis 11

2. Insuliini biosüntees ja bioloogiline toime 12

3. Insuliini füüsikalis-keemiliste ja farmatseutiliste omaduste üldised omadused 15

4. Insuliini preparaadid 24

5. Insuliinipreparaatide tootmise meetodid, standardimine ja kvaliteedikontroll 31

6. HPLC kasutamine insuliini farmatseutilises analüüsis. 46

2. PEATÜKK Probleemi avaldus 50

3. PEATÜKK Uuring erinevate tegurite mõju kohta insuliini kromatograafilisele käitumisele RP HPLC tingimustes 56

1. Meetodid ja materjalid 57

2. Tulemuste arutamine 62

2.1. Puhverlahuse 62 koostise mõju

2.2. Naatriumsulfaadi kontsentratsiooni mõju 68

2.3. Kromatograafilise kolonni temperatuuri 70 mõju

2.4. Orgaanilise modifitseerija 75 mõju

2.5. Pookitud faasi alküülradikaali pikkuse 80 mõju

2.6. Kromatograafilise kolonni 80 pikkuse mõju

4. PEATÜKK. Farmakopöa meetodite täiustamine insuliinipreparaatide analüüsimiseks RP HPLC 82 alusel

1. Optimaalsete tingimuste valimine insuliini ja selle lisandite kromatograafiliseks määramiseks ravimpreparaatides 82

2. Meetodi metroloogilised omadused 84

3. Välja töötatud metoodika rakendamine ametlike insuliinipreparaatide testimiseks 95

5. PEATÜKK PF HPLC meetodil põhinevate isofaan-insuliini süstitavate annusvormide analüüsimeetodite väljatöötamine 107

1. Protamiini kromatograafilise määramise tingimuste valik isofaan-insuliini annusvormides 110

2. Erinevatest kalaliikidest eraldatud protamiinide kromatograafiliste profiilide uurimine 121

3. Meetod protamiini määramiseks isofaan-insuliini preparaatides 123

4. Välja töötatud metoodika valideerimine 125

Üldised järeldused 136

Viited 139

Insuliini füüsikalis-keemiliste ja farmatseutiliste omaduste üldised omadused

Keemilisest vaatepunktist on insuliin väikeseks globulaarseks valguks, mille molekulmass on kuni 6000 Da. Samal ajal tuleb märkida, et insuliin on üldine loodusliku ja kunstliku päritoluga homoloogiliste valkude perekond, millel on ühine iseloomulik bioloogiline aktiivsus. Insuliini valgu olemus loodi 1928. aastal [52]. See on valkude seas, mis tekitavad biureetreaktsiooni ja Pauli reaktsiooni. Insuliini struktuur oli täielikult välja kujunenud 50ndate alguses. Eri päritoluga insuliinide elementaarset keemilist koostist iseloomustab tabelis 1 toodud arvud [40].

Aminohapete koostis. Enamik insuliinimolekule sisaldavad 51 aminohappejääki, sealhulgas 17 aminohapet, mis on leitud enamikus tuntud valkudes.

Veiste, sigade ja iniminsuliini aminohapete koostise iseloomulik tunnus on trüptofaan ja metioniin. Nende insuliinitüüpide aminohappeline koostis on esitatud tabelis 2 [40,46].

Kõikide insuliinitüüpide puhul on tsüstiini sisaldus (6 pooltsüstiini jääki). Lisaks sisaldab igat tüüpi insuliinimolekul 6 amiidrühma (asparagiin, glutamiin).

Kui insuliin vabaneb, võib koos peamise fraktsiooniga täheldada insuliini deamüdeeritud vormide fraktsioone. Happelises keskkonnas, deamideerimise protsessis, võib kõik 6 amiidi rühma järk-järgult eraldada ning insuliini muutuste elektroforeetiline ja kromatograafiline liikuvus [40]. Deamidaaditud insuliinivormide moodustumist võib hinnata ammoniaagi määramise tulemuste põhjal. Insuliini täielikult amiidvormi jaoks määratakse 6 mooli ammoniaaki 1 mooli valgu kohta, deamideeritud vormide puhul võib see väärtus olla 5 kuni 0.

Insuliini esmane struktuur. Insuliini esmase struktuuri dekodeeris Sanger grupp 1945-1955. Kasutades mitmeid kromatograafilisi meetodeid, mis võimaldasid eraldada ja identifitseerida erinevaid peptiide, aminohappeid ja nende derivaate, suutis Sanger tuvastada veise insuliini primaarse struktuuri [130, 131, 132, 133, 134, 135]. Erinevate päritoluga insuliinide edasised uuringud, kasutades mitmesuguseid füüsikalis-keemilisi meetodeid, kaasa arvatud Edmani meetod aminohappejärjestuse määramiseks pikkades peptiidides, kinnitas Sanger ja tema kaasautorite järeldusi insuliini struktuuri kohta [bb].

Praeguseks on insuliini esmane struktuur kindlaks määratud nelja loomaliigi 24 liigi esindajate hulgas: imetajad, linnud, kalad ja tsüklostoomid [14]. Jätkuvad erinevate päritoluga insuliini uuringud [71,72,73].

Insuliini struktuur erinevates loomades on sarnane, kuid mitte identne. Iniminsuliin on oma esmases struktuuris sarnane sigade, koerte, sperma vaalade ja küüliku insuliinidega, mis erinevad ainult ühest aminohappest [40]. See erineb veisinsuliinist kolme aminohappega. Iniminsuliin ei ole enam sarnane Guinea sea, lindude ja kalade insuliiniga [40]. Inimese, sigade ja veiste insuliinide aminohappejärjestuse erinevused on toodud tabelis 3.

Vaatamata struktuurilistele erinevustele on kõikidel insuliinitüüpidel sarnane bioloogiline aktiivsus, s.t. põhjustada hüpoglükeemilist toimet. Näidatud bioloogilise aktiivsuse ulatus sõltub aga tugevalt liigist ja on vahemikus 11 RÜ / mg (Põhjamere tursaminsuliin) kuni 62 RÜ / mg (kalkun ja kana insuliin), samas kui inimese insuliini aktiivsus on umbes 25-30 IU. / mg [40]. Mida suurem on eri liikide vahelised erinevused, seda suurem on vastava insuliini bioloogilise aktiivsuse erinevus.

Funktsionaalselt aktiivne insuliinimolekul koosneb kahest polüpeptiidahelast (A ja B ahelad), mis on seotud disulfiidsidemetega; ühe sideme moodustavad mõlema ahela seitsmes aminohappejääk, teine disulfiidsidem moodustub A-ahela 20. jäägi ja B-ahela 19. jäägi poolt (joonis 2). Lisaks on insuliinimolekulis kolmas disulfiidsidem, mis on intrakaiin ja ühendab 6. ja 11. A-ahela jäägid [59,117].

Sekundaarne struktuur Kasutades erinevaid füüsikalis-keemilisi ja füüsikalisi uurimismeetodeid, näidati, et insuliinimolekulil on kõrgelt korraldatud ruumiline struktuur (konformatsioon), mis aitab kaasa spetsiifiliste bioloogiliste funktsioonide rakendamisele [14]. Natiivse insuliini molekulis on samaaegselt olemas nii cc-heeliks kui ka p-fold lehed. Lisaks sellele on piirkondi, kus on korrastamata struktuur ja struktuur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Kui insuliini happelist lahust (pH 2,3-2,5) kuumutatakse temperatuuril +100 ° C ja jahutatakse kiiresti temperatuurini -80 ° C, moodustub nn fibrillaarne insuliin - hormooni täiesti inaktiivne vorm [27]. Fibrillaarse insuliinikiudude sisseviimine aktiivse insuliini lahusesse põhjustab spontaanset kvantitatiivset insuliini sadestumist fibrillide kujul [14,17].

Insuliinipreparaatide tootmise meetodid, standardimine ja kvaliteedikontroll

Loomade insuliiniliikide saamine. Veiseliha ja sealiha insuliini tööstuslik tootmine loodi peaaegu samal ajal paljudes riikides, kohe pärast insuliini avastamist 1921. aastal [63]. Sellest ajast alates on insuliini saamise mõiste praktiliselt muutunud (tabel b) [17, 18]. Insuliini loomaliikide tootmiseks kasutatavad toormaterjalid on toidu jaoks kasutatavate tapaloomade kõhunääre.

Insuliini tootmise kõige olulisem ülesanne on selle puhastamine - ainete eraldumine seonduvatest lisanditest, mis vähendavad bioloogilist aktiivsust, põhjustavad immunoloogilisi reaktsioone või on potentsiaalselt ohtlikud patsiendi tervisele. Näiteks pärast mitme aasta möödumist, kui kasutati patsiendi veres halvasti puhastatud insuliini, võib antikehadega seonduda kuni 5000 RÜ insuliini. Insuliinivastased antikehad mõjutavad oluliselt selle toime profiili ja aitavad seega kaasa labiilse diabeedi kulgemisele.

Esimene meetod insuliini puhastamiseks oli ümberkristallimine tsingisoolade juuresolekul. 1945. aastal näidati, et insuliini seitsmekordne ümberkristallimine vähendab oluliselt allergiliste reaktsioonide taset patsientidel võrreldes ametlike insuliinipreparaatidega sel ajal [63].

Insuliiniproovide heterogeensust pärast kristallimist ja ühekordset ümberkristallimist on näidatud mitmesuguste meetoditega: vastuvoolu ekstraheerimine (PE), jaotuskromatograafia (PX), ioonivahetuskromatograafia (IOC), diskelektroforees (DEP) ja geelist väljatõrjumise kromatograafia (GEC) [63].

Leiti, et peamised kaasnevad insuliini lisandid on: proinsuliin, selle vahesaadused, kovalentne insuliindimeer, mono-disamido insuliin, monoarginiin ja mono-etüleen, samuti mitmed suure molekuliga ühendid, mis ei ole insuliini. Uuringute tulemuste üldine järeldus, võttes arvesse teavet tuvastatud lisandite immunoloogilise aktiivsuse kohta [138], oli järeldus insuliinainete täiendava puhastamise vajaduse kohta, nii et DEF- ja GEC-meetodite analüüsimisel leiti üks komponent - vastav insuliin.

Insuliini puhastamise probleemi lahendamiseks 1950. aastal pakuti välja HEC-meetod ja 1970. aastal anioonivahetuskromatograafia (AOX) meetod. Leiti, et AOX-meetodil puhastatud insuliin sisaldab proinsuliini aktiivsusega umbes 500 ppm (miljondikku osa) lisandeid [137]. Insuliini täiendav puhastamine kõrgsurvevedelikkromatograafia abil pöördfaasidel (RP HPLC) vähendab immunogeensete fraktsioonide sisaldust nende avastamise piirini [63].

Insuliini kromatograafilise puhastamise valdkonna praeguste arengute ülevaade on esitatud [96]. Insuliini, mis on puhastatud järjestikku, kasutades IOC ja GEC, nimetatakse monokomponendiks olevaks insuliiniks [63]. Iniminsuliini saamine. Iniminsuliini saamise meetodite otsimine oli tingitud kahest asjaolust. Ühest küljest andis tooraineprobleemi kiireloomulisus loominsuliini tootmise puhul aga teaduse kiire areng selles valdkonnas tõelise võimaluse selle idee ellu viia. 1979. ja 1981. aastal peaaegu samal ajal töötati välja kaks meetodit iniminsuliini saamiseks - biosünteetilised ja poolsünteetilised [102,108]. 1981. aastal alustas ettevõte Novo Nordisk esimest korda maailmas poolsünteetilise insuliini tootmist. Ettevõtte kasutatav meetod põhineb Ali ensümaatilisel ja keemilisel asendamisel sigade insuliini molekulis ülejäänud Tre [61] -ga. See meetod sõltub otseselt vajaliku koguse seainsuliini saamisest, mis vähendab selle majanduslikku väärtust. Rekombinantse DNA tehnoloogia väljatöötamisel ilmnes võimalus saada biosünteetilise meetodiga iniminsuliini [10]. Umbes 25 aastat tagasi algas geneetiliselt muundatud insuliinitootmine. 1978. aastal teatati, et saadi roti proinsou-lingit tootev E. coli tüvi. 1979. aastal suutis Genentechi uuringud kloonida aminohappejärjestusi kodeerivad geenid E. coli. pBR322 plasmiidi p-halo-takidaasi piirkonnas sisalduvad insuliiniahelad A ja B [10102]. 1981. aastal sünteesiti mini-C-proinsuliini proinsuliini geenianaloog, milles 35-liikmeline C-peptiid asendati kuue aminohappe segmendiga: arg-arg-glütser-lys-arg ja selle ekspressioon E. colis. 1982. aastal alustas ettevõte Eli Lilly maailma esimest iniminsuliini tööstuslikku tootmist, kasutades kahesahelist tehnoloogiat, mis töötati välja koostöös Genentechiga [102]. Praegu on näidatud võimalust saada iniminsuliini erinevate ekspressioonisüsteemide abil [3,10,101,102]. Majanduslikust seisukohast on eriti huvipakkuvaks geneetiliselt muundatud geen-positiivsete E. coli bakterite kasutamine, millest paljud loetakse ülemäärasteks tootjateks [3]. Samal ajal saavutati märkimisväärne edu Saccharomices cerevisiae pärmirakkudega [3,75]. Tabelis 7 on loetletud peamised rekombinantse iniminsuliini tootmise meetodite ühised, tehnoloogilise protsessi etapid [3,10,63].

Välja töötatud metoodika rakendamine ametlike insuliinipreparaatide testimiseks

Kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) on kolonnis kasutatava vedelikkromatograafia variant, milles liikuv faas - eluent - läbib kolonni täitva sorbendi suure kiirusega (kuni 400x105 Pa) kolonni sissepääsu juures [11].

Komplekssete ainete segude analüüsiks ilmnes HPLC veidi üle 30 aasta tagasi. Sorbentide kasutamine osakeste läbimõõduga 3–10 μm põhjustas kromatograafilise eraldamise tõhususe järsu tõusu võrreldes klassikalise kolonnivedelikkromatograafia versiooniga. Seetõttu nimetatakse HPLC-d sageli kõrgsurvevedelikkromatograafiaks (HPLC). HPLC kasutamise instrumentaalseid omadusi on üksikasjalikult kirjeldatud arvukates käsiraamatutes [49.50] ja juhtivate farmakopöade asjakohastes osades [79,150]. HPLC jaoks on välja töötatud ja toodetud suur hulk sorbente. Uuringu autorite [51] andmetel toodavad umbes 100 ettevõtet kogu maailmas rohkem kui 300 sorbendi nime. Metoodika ajalugu, praegune olukord ja väljavaated on arutatud ülevaadetes [51] ja [77.78].

Oma mitmesugustes variantides kasutatakse HPLC meetodit laialdaselt farmatseutilises analüüsis (tootmise kontroll ja ravimikvaliteedi testimine). Meetod on lisatud maailma juhtivatele farmakopöadele. Seda meetodit kirjeldatakse kõige paremini Euroopa ja Ameerika farmakopöades. HPLC-d kasutatakse ravimite identifitseerimiseks, et määrata puhtus, molekulmassi fraktsiooniline koostis ja kvantitatiivne analüüs. USA farmakopöas 28 ed. umbes 30% eratoodetest on seotud HPLC-ga. Euroopa farmakopöas 4. väljaanne. see arv on umbes 40%.

Esimene insuliinianalüüsi kromatograafia meetod oli madala rõhuga geelist väljutamise vedelikkromatograafia (GE ZhND). HPLC tingimustes eraldamise põhimõte põhineb erinevate suurustega molekulide erinevatel võimetel tungida neutraalse geeli pooridesse, mis toimib statsionaarse faasina. Insuliinmonomeeri ja dimeeri hüdrodünaamiline diameeter on proportsionaalne nende molekulmassiga ja on vastavalt 2,69 ja 5,50 nm [115].

1967. aastal, kasutades GE-IHDD meetodit, näidati, et kristallimisega puhastatud insuliini kaubanduslikud preparaadid sisaldavad lisandeid, mille molekulmass ületab insuliini molekulmassi [63]. Sigade insuliini kromatogrammidel leiti kolm piiki, mida tavapäraselt nimetati a-, b- ja c-komponentideks. Sellest ajast alates on pakutud mitmeid kromatograafilisi süsteeme, et reguleerida suure molekulmassiga lisandite sisaldust insuliinipreparaatides. Eraldamine viidi läbi väga punduvatel agaroos-kserogeelidel (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Või dekstraan (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), etüülhappe lahustena kasutati 1-3 M lahust [127]. Nende sorbentide kõrge tundlikkus maatriksi paisumisrõhku ületavate survetegurite survestamisel muudab need materjalid HPLC-režiimis kasutamiseks sobimatuteks.

Geelist väljutamise vedelikkromatograafia kasutamist kõrge rõhu juures (GE HPLC) insuliinianalüüsi jaoks kirjeldati esmakordselt 1980. aastal pärast kõvade makropoorsete sorbentide väljatöötamist, mis sobivad kokku veega ja talusid kõrget survet. [151] teostati eraldamine kolonnidel Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) denatureerimise tingimustes (7M uurea, mineraalhapete ja mitteioonsete lahuste kombinatsioon) detergendid). Insuliinianalüüsi vajadus denatureerivates tingimustes on seotud insuliini võimega agregeerida lahuses. Insuliini eraldamiseks HPLC HPLC tingimustes on kirjeldatud ka "traditsioonilise" eluendi äädikhappe kasutamist [152]. Äädikhappe kasutamisel on mitmeid eeliseid - minimaalne mõju eraldatud ühendite natiivsele struktuurile, kättesaadavus, madalad kulud, lisaks on oluline asjaolu, et äädikhape suudab pärssida insuliini seost.

Praegu on HPLC ghvd farmakopöa meetod ainete ja valmis ravimvormide suure molekulmassiga lisandite sisalduse jälgimiseks. Meetodit kasutatakse ka protamiini sisalduse määramiseks isofaan-insuliini preparaatides.

HPLC kasutamine pöördfaasidel (RP HPLC) veiste ja sigade insuliini eraldamiseks esmakordselt näitas selle meetodi kõrget efektiivsust sarnase struktuuriga insuliinitaoliste peptiidide analüüsimisel.

Valkude ja polüpeptiidide eraldamise mehhanism RP HPLC tingimustes põhineb insuliinimolekulide ja nendega seotud lisandite erinevatel hüdrofoobsustel. Praeguseks on kirjeldatud mitmeid kümneid erineva päritoluga insuliini ja nende derivaatide, kaasa arvatud proin-suliini, pankrease polüpeptiide, dezamido derivaate, insuliini dimeeri, kromatograafilise eraldamise meetodeid. [126] näitas võimalust kana, küüliku, lamba ja hobuse insuliini eraldamiseks. Eraldati ka inimese, veiseliha ja sealiha insuliin. Lloyd ja Corran avaldasid meetodi veiseliha, sealiha, iniminsuliinide ja nende vastavate deamideeritud vormide eraldamiseks [104].

Eraldamine viiakse läbi silikageeli sorbentidega modifitseeritud metüül-, butüül-, oktüül-, oktadetsüül- ja fenüülrühmades isokraatlikus või gradientrežiimis. PF-i puhul kasutatakse orgaanilisi modifikaatoreid - atsetonitriili, metüülalkoholi, isopropüülalkoholi, mis on segatud anorgaanilisi sooli ja ioon-auru reaktiive sisaldavate puhverlahustega. Maksimaalne avastamine toimub peamiselt spektrofotomeetrilise meetodiga lainepikkusel 190-220 nm, samuti kirjeldatakse fluoromeetrilisi meetodeid [103].

Aine ja insuliini valmisvormide analüüs RP HPLC abil on kirjeldatud Ameerika ja Euroopa farmakopöa eraviisilistes artiklites [79,150]. Seda meetodit kasutatakse määratletud rühma ravimite testimiseks "insuliini autentsuse", "seotud valkude", "kvantitatiivse määramise" ja "lahuse lahuses" tähenduses.

Teaduskirjanduses kirjeldatakse ka ioonvahetuse ja afiinsuskromatograafia kasutamist insuliini analüüsiks [44,102], kuid neid meetodeid ei ole farmakopöa praktikas laialdaselt kasutatud.

Protamiini kromatograafilise määramise tingimuste valik isofaan-insuliini annusvormides

PF ioonse tugevuse suurenemine põhjustab tavaliselt insuliinivõimsuse suurenemise, mis võib olla tingitud paljudest teguritest: - ioonikontsentratsiooni suurendamine vähendab valgumolekuli laetud rühmade ionisatsiooni astet, suurendades selle hüdrofoobsust / - katioonide suur kontsentratsioon aitab vabade silanoolrühmade sõelumist statsionaarsel pinnal faas, mis nõrgendab valgu protoonitud aminorühmade mittespetsiifilist elektrostaatilist koostoimet maatriksiga; - kõrge ioontugevus mõjutab insuliini ruumilist struktuuri, mille tulemusena muutub sorbendi interaktsioonile kättesaadav pind. Anorgaaniliste soolade kontsentratsioon FS-is mõjutab piikide kuju ja insuliini ja desamido-Asn-insuliini eraldamise selektiivsust [143,144]. Isokraatliku elueerimise teel LiChrosorb Сів sorbendil 0,1 M naatriumfosfaadi lahusega (pH 2,3) saavutati rahuldav tulemus ainult siis, kui puhverlahusele lisati naatriumsulfaat kontsentratsioonini 0,1 M. Enamik insuliinianalüüsi meetodeid, mis sisalduvad farmakopöaartiklites ja ND-s kasutage PF puhvri lahuste alusel, mille naatriumsulfaadi sisaldus on 0,2 M. Selline kõrge naatriumsulfaadi sisaldus mõjutab negatiivselt kromatograafia tulemuste reprodutseeritavust eluentide kihistumise tõttu, väga kontsentreeritud soolalahused avaldavad kromatograafilisele seadmele negatiivset mõju, lühendades selle kasutusiga. Arvestades, et farmakopöa analüüsimeetodid töötati välja rohkem kui 20 aastat tagasi, tundus huvitav uurida insuliini kromatograafilist käitumist OF-HPLC-ga viimase põlvkonna kromatograafilistel sorbentidel, sõltuvalt naatriumsulfaadi kontsentratsioonist. Samal ajal püüdsid nad välja selgitada, kas naatriumsulfaadi sisalduse vähenemine PF-is on lubatud ilma kromatograafilise süsteemi eraldusvõime olulise halvenemiseta. Uuringu tulemusena leiti, et naatriumsulfaadi kontsentratsiooni mõju PF-is on erinev, sõltuvalt siirdatud faasi tüübist, samuti insuliiniliigist. Sorbentidel poogitud rühmadega C4 ja C inimese insuliini ja desamido-Asn-inimese insuliini piikide eraldamise selektiivsus ei sõltu naatriumsulfaadi kontsentratsioonist. puhverlahus vahemikus 0,05 kuni 0,2 M. Diaspher-110-C18 sorbendil on selle paari paari eraldamise selektiivsus maksimaalselt 0,05 M ja minimaalne 0,1 M juures (diagramm 4). Teisest küljest ei sõltu insuliini loomaliikide ja nende vastavate desamiinitud AsnA21 vormide eraldamise selektiivsus lahuse ioontugevusest, kui see eraldatakse Diaspher-110-C18 sorbendil. C8-siirdatud rühmadega sorbendil suureneb selektiivsus 1,25-lt 1,28-ni naatriumsulfaadi kontsentratsiooni suurenemisega (joonis 4). C4-ga poogitud rühmade sorbendil on veiselihasisese insuliini puhul eraldamise selektiivsus maksimaalne 0,1 M naatriumsulfaadi puhul ja minimaalne 0,2 M juures. Sealihasisese insuliini puhul ei ole 0,1 M naatriumsulfaadi kontsentratsioonis väljendunud maksimaalset maksimaalset kontsentratsiooni, antud juhul ioonhappe suurenemist. jõud põhjustasid eraldamise selektiivsuse vähenemist (joonis 4). Tõhusate teoreetiliste plaatide arv suureneb naatriumsulfaadi kontsentratsiooni suurenemisel. Erandiks on iniminsuliini käitumine sorbendil Diasfer-110-C8 (joonis 5). Insuliini ja desamido-Asn-insuliini piikide eraldumise aste suureneb FS ioonse tugevuse suurenemisega, sõltumata insuliiniliigist ja poogitud faasi tüübist (skeem b). Naatriumsulfaadi kontsentratsiooni 0,2 M kuni 0,1 M redutseerimisel väheneb valitud piikide paari eraldusaste inimese ja sea insuliini puhul keskmiselt 5% ja veiseliha insuliini puhul 10%. Arvestades asjaolu, et eraldatuse astme absoluutväärtus ületab 2,0, ei ole kolonni eraldusvõime mõõdetud halvenemine meie arvates oluline. Seega võib naatriumsulfaadi kontsentratsiooni puhverlahuses PF vähendada 2 korda võrreldes farmakopöa analüüsimeetoditega.

Enamikes uuringutes valkude ja peptiidide analüüsi kohta viiakse eraldamine läbi toatemperatuuril. Lisaks näitavad mõned autorid, et temperatuuri mõju eraldamise selektiivsusele on minimaalne [48]. Siiski, kui temperatuur tõuseb, kiireneb statsionaarsete ja liikuvate faaside vaheline massivahetus, mis viib peptiidide retentsiooniaja vähenemiseni ja piikide kitsenemisele.

Insuliinitehnoloogia

Insuliini sekretsiooni rikkumine. Partnerfotograafia kasutamine. Insuliini skeem. Proinsuliini ekspressioon E. coli rakkudes. Lähenemisviisid diabeedi probleemi lahendamiseks. Biotehnoloogia panus mittepeptiidhormoonide tööstuslikku tootmist.

Saada oma hea töö teadmistebaas on lihtne. Kasutage allolevat vormi.

Õpilased, kraadiõppe üliõpilased, noored teadlased, kes kasutavad oma teadmiste baasi õpingutes ja töös, on teile väga tänulikud.

Postitatud http://www.allbest.ru/

KAZAKSTANI VABARIIGI HARIDUS- JA TEADUSMINISTEERIUM

KAZAKH AGRO-TEHNILINE Ülikool tähistati pärast S.SEfulliini

Mikrobioloogia ja biotehnoloogia osakond

Distsipliinil "Biotehnoloogia mokroorganizmov"

Teema: insuliini tehnoloogia

Lõpetatud: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek?

Kontrollitud: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

LÜHENDID JA SÜMBOLID

1. Avastamise ajalugu

2. Insuliini kasutamine biotehnoloogias

3. Kuidas saada iniminsuliini

4. Proinsuliini ekspressioon E. coli rakkudes

5. Insuliini puhastamine

6. Annustamine ja manustamine

Selles kursuses kasutati järgmisi mõisteid:

Valgu kandja - hübriidvalgu transportimine raku või söötme periplasmaatilisse ruumi;

Afiinsuskomponent - hõlbustab oluliselt hübriidvalgu valimist.

Pankrease Langerhans'i saarekeste beetarakkudesse moodustub insuliin (ladina keelest Insula - saar) - peptiidhormoon.

Interleukiinid on tsütokiinide rühm, mis on sünteesitud peamiselt leukotsüütide poolt (sel põhjusel valiti lõpp--ukukiin).

Proinsuliin on insuliini sünteesitud insuliini prekursor kõhunäärme saarerahva B-rakkude poolt.

Kromatograafia (kreekakeelsest, Chroma, kromatograafia - värv, värv), füüsikalis - keemiline meetod lahuste eraldamiseks ja analüüsimiseks, mis põhineb nende komponentide jaotumisel kahe faasi vahel - statsionaarne ja mobiilne (eluent), mis voolab läbi statsionaarse.

Kapseldamine - programmeerimiskeelemehhanism, mis piirab juurdepääsu elementidele, mis moodustavad objekti (meetodid ja omadused), muudab need privaatseks, st on ligipääsetavad ainult objekti sees.

Liitvalk (fusioonproteiin, ka kimäärne ühendvalk) on valk, mis on saadud kahe või enama geeni kombineerimisel, mis algselt kodeerisid eraldi valke.

Hormonid (kreeklastelt. Hormao - liikuma, indutseerida), hormoonid, bioloogiliselt aktiivsed ained, mida toodavad endokriinsed näärmed või endokriinsed näärmed ja mida need eritavad otse verre.

Suhkurtõbi on endokriinsete haiguste rühm, mis areneb hormooninsuliini absoluutse või suhtelise puudulikkuse tõttu.

Somatostatiin on Langerhani pankrease saarekeste delta-rakkude hormoon, samuti üks hüpotalamuse hormoonidest.

Radioimmuunanalüüs on meetod bioloogiliste toimeainete (hormoonid, ensüümid, ravimid jne) kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes vedelikes, tuginedes soovitud stabiilsuse siduvale sidumisele ja sarnastele radionukliidiga märgistatud ainetele, millel on spetsiifilised sidumissüsteemid.

LÜHENDID JA SÜMBOLID

HPLC - suure jõudlusega vedelikkromatograafia

cDNA - komplementaarne desoksüribonukleiinhape

Insuliini põhiülesanne on tagada glükoosimolekulide rakumembraanide läbilaskvus. Lihtsustatud vormis võib öelda, et mitte ainult süsivesikud, vaid ka kõik toitained jagunevad glükoosiks, mida kasutatakse teiste süsinikku sisaldavate molekulide sünteesimiseks, ning see on ainus kütuse liik rakkude elektrijaamadele - mitokondrid. Ilma insuliinita langeb rakumembraani läbilaskvus glükoosile 20 korda ja rakud surevad nälga ning veres lahustunud suhkru mürgib keha.

1. tüüpi suhkurtõve patogeneesi võtmetegur on beeta-rakkude hävimisest tingitud insuliini sekretsiooni kahjustus - absoluutne insuliinipuudus. Insuliini mõju koe - suhtelise insuliini puudulikkuse - rikkumisele on oluline koht II tüüpi diabeedi arengus.

Afiinsuskromatograafia kasutamine on oluliselt vähendanud saasteainete sisaldust preparaadis, mille molekulmass on suurem kui insuliin. Selliste valkude hulka kuuluvad proinsuliin ja osaliselt lõhustatud proinsuliinid, mis on võimelised indutseerima antiinsuliini antikehade tootmist.

Iniminsuliini kasutamine ravi algusest vähendab allergiliste reaktsioonide esinemist. Iniminsuliin imendub kiiremini ja sõltumata ravimi vormist on toime lühem kui loominsuliin. Inimese insuliinid on vähem immunogeensed kui sealiha, eriti veiste ja sigade segud.

Selle kursuse töö eesmärk on uurida insuliini tehnoloogiat. Järgmiste eesmärkide saavutamiseks määrati kindlaks:

1. saada insuliini biotehnoloogiasse

2. Kuidas saada insuliini

H. Insuliini puhastamine

Insuliini avastamise ajalugu on seotud Vene arsti I.M. nimega. Sobolev (19. sajandi teine pool), kes tõestas, et suhkru taset inimveres reguleerib kõhunäärme eriline hormoon.

1922. aastal tutvustati esimest korda kümneaastasele poisile looma kõhunäärmest eraldatud insuliini, diabeetik ületas kõik ootused ja aasta hiljem vabastas Ameerika ettevõte Eli Lilly esimese loominsuliini preparaadi.

Pärast esimese tööstusliku insuliinipartii saamist on lähiaastatel läbinud suure tee selle eraldamiseks ja puhastamiseks. Selle tulemusena sai hormoon I tüüpi diabeediga patsientidele kättesaadavaks.

1935. aastal optimeeris Taani teadlane Hagedorn insuliini toimet kehas, pakkudes välja pikaajalist ravimit.

Esimesed insuliini kristallid saadi 1952. aastal ja 1954. aastal krüpteeris Inglise biokeemik G. Senger insuliini struktuuri. Meetodite väljatöötamine hormooni puhastamiseks teistest hormonaalsetest ainetest ja insuliini lagunemisproduktidest võimaldas saada homogeenset insuliini, mida nimetatakse ühekomponendiliseks insuliiniks.

70ndate alguses. Nõukogude teadlased A. Yudaev ja S. Shvachkin pakkusid välja insuliini keemilise sünteesi, kuid selle sünteesi rakendamine tööstuslikus mastaabis oli kallis ja kahjumlik.

Tulevikus paranes järk-järgult insuliinide puhastusaste, mis vähendas insuliinialergiate, neerufunktsiooni kahjustuse, nägemishäirete ja immuunsusinsuliini resistentsuse tekitatud probleeme. Kõige efektiivsem hormoon oli vajalik suhkurtõve asendusraviks - homoloogne insuliin, st iniminsuliin.

80-ndatel aastatel võimaldas molekulaarbioloogia edusammud sünteesida mõlemad E. coli abil kasutatavad iniminsuliini ahelad, mis seejärel kombineeriti bioloogiliselt aktiivseks hormoonimolekuliks ja rekombinantne insuliin saadi Vene Teaduste Akadeemia Bioorgaanilise Keemia Instituudis E. coli geneetiliselt muundatud tüvede abil.

2. Insuliini kasutamine biotehnoloogias

Insuliin, Langerhani pankrease saarekeste peptiidhormoon, on diabeedi peamiseks raviks. Selle haiguse põhjuseks on insuliini puudus ja see väljendub vere glükoosisisalduse suurenemises. Hiljuti saadi insuliin pullist ja sigast. Ravim erines iniminsuliini 1-3 aminohappe asendusest, nii et esines allergiliste reaktsioonide oht, eriti lastel. Insuliini ulatuslikku terapeutilist kasutamist piiras selle kõrge hind ja piiratud ressursid. Keemilise modifitseerimise teel tehti loomade insuliin inimesest eristamatuks, kuid see tähendas toote lisakulude suurenemist [1].

Alates 1982. aastast on Eli Lilly tootnud geneetiliselt muundatud insuliini, mis põhineb E. colie ja B-ahelate eraldi sünteesil. Toote maksumus on oluliselt vähenenud, toodetud insuliin on inimese omadega identne. Alates 1980. aastast on ajakirjanduses teatatud proinsuliini geeni kloonimisest, mis on hormooni eelkäija, mis läbib piiratud proteolüüsi läbinud küpsesse vormi.

Ka kapseldamise tehnoloogia on seotud diabeedi raviga: pankrease rakud kapslis, mis sisestatakse üks kord patsiendi kehasse, toodavad insuliini ühe aasta jooksul.

Integreeritud geneetika on käivitanud folliikuleid stimuleerivate ja luteiniseerivate hormoonide tootmise. Need peptiidid koosnevad kahest allüksusest. Päevakorras on närvisüsteemi oligopeptiidhormoonide, 5 aminohappejäägist ja endorfiinidest, morfiinanaloogidest ehitatud tööstusliku sünteesi küsimus. Nende peptiidide ratsionaalsel kasutamisel leevendavad valu, loovad hea tuju, suurendavad tõhusust, keskenduvad tähelepanu, parandavad mälu, panevad sisse une ja ärkveloleku. Geenitehnoloogia meetodite edukaks rakendamiseks on näiteks β-endorfiini süntees, kasutades ülalkirjeldatud hübriidvalgu tehnoloogiat teise peptiidhormooni, somatostatiini [2] jaoks.

3. Kuidas saada iniminsuliini

Ajalooliselt on esimene viis insuliini saamiseks terapeutilistel eesmärkidel isoleerida selle hormooni analooge looduslikest allikatest (veiste ja sigade pankrease saarekestest). Viimase sajandi kahekümnendatel aastatel leiti, et veiste ja sigade insuliinid (mis on inimese insuliinile kõige lähemal struktuuris ja aminohappejärjestuses) näitavad inimorganismis aktiivsust, mis on võrreldav iniminsuliiniga. Pärast seda kasutati veiste või sigade insuliini 1. tüüpi diabeediga patsientide raviks pikka aega. Mõne aja pärast ilmnes siiski, et mõnel juhul hakkavad inimese kehas kogunema veiste ja sigade insuliinide vastased antikehad, mis kaotavad nende toime.

Teisest küljest on selle insuliini saamise meetodi üheks eeliseks toorainete kättesaadavus (veiste ja sigade insuliini saab kergesti saada suurtes kogustes), mis mängis otsustavat rolli esimese iniminsuliini saamise meetodi väljatöötamisel. Seda meetodit nimetatakse poolsünteetiliseks [3].

Selles iniminsuliini valmistamise meetodis kasutati toormaterjalina seainsuliini. Puhastatud seainsuliin lõhustati B-ahela C-terminaalse oktapeptiidiga, mille järel sünteesiti inimese insuliini C-terminaalne oktapeptiid. Seejärel lisati see keemiliselt, kaitserühmad eemaldati ja saadud insuliin puhastati. Insuliini saamise meetodi testimisel näidati saadud hormooni täielik identiteet inimese insuliinile. Selle meetodi peamiseks puuduseks on saadud insuliini kõrge maksumus (isegi praegu on oktapeptiidi keemiline süntees kulukas, eriti tööstuslikus mahus).

Praegu saadakse iniminsuliini peamiselt kahel viisil: sealiha insuliini modifitseerimisel sünteetilise ensümaatilise meetodiga ja geenitehnoloogia meetodil.

Esimesel juhul põhineb meetod asjaolul, et sigade insuliin erineb iniminsuliinist Ala30Thr B-ahela C-otsas ühe asendusega. Alaniini asendamine treoniiniga viiakse läbi alaniini ensüüm-katalüüsitud lõhustamisega ja selle asemel kinnitatakse reaktsioonisegus sisalduv karboksüül-kaitstud treoniinijääk suure liiaga. Pärast kaitsva O-tert-butüülrühma lõhustamist saadakse inimese insuliin. (pilt 1)

Joonis 1 - Iniminsuliini tootmise meetodite skeem

Insuliin oli esimene kaubanduslikul eesmärgil saadud rekombinantse DNA tehnoloogia abil saadud valk. Geneetiliselt muundatud iniminsuliini saamiseks on olemas kaks peamist lähenemisviisi. Esimesel juhul toodavad eraldi (erinevad tootjate tüved) mõlemad ahelad, millele järgneb molekuli voltimine (disulfiidsildade moodustumine) ja misoformide eraldamine. Teises, preparaadis prekursori (proinsuliini) kujul, millele järgneb ensümaatiline lõhustamine trüpsiini ja karboksüpeptidaasiga. Hormooni aktiivsesse vormi. Praegu on kõige eelistatumaks insuliini tootmine prekursorina, mis tagab disulfiidsildade õige sulgemise (ahelate eraldi tootmise korral toimub järjestikuste denatureerimise tsüklite, misoformide ja renaturatsiooni eraldamine [3]).

Mõlemal juhul on võimalik nii individuaalselt saada lähtekomponente (A ja B ahelad või proinsuliin) kui ka hübriidvalkude osana. Lisaks A- ja B-ahelatele või proinsuliinile võib hübriidvalkude koostises esineda:

1) kandjavalk - hübriidvalgu transportimine raku või söötme periplasmaatilisse ruumi;

2) afiinsuskomponent - hõlbustab oluliselt hübriidvalgu valimist.

Samal ajal võivad mõlemad komponendid esineda samaaegselt hübriidvalgu koostises. Lisaks võib hübriidvalkude loomisel kasutada mitmemõõtmelisuse põhimõtet (see tähendab, et hübriidvalgus on mitu sihtmärk-polüpeptiidi koopiat), mis võimaldab sihttoote saagist oluliselt suurendada [4].

Me kasutasime JM 109 N1864 tüve nukleotiidijärjestusega, mis oli integreeritud plasmiidi, mis ekspresseerib hübriidvalku, mis koosneb lineaarsest proinsuliinist ja Astaphylococcusaureus'i valgu fragmendi fragmendist, mis on kinnitatud selle N-otsa kaudu metioniini jäägi kaudu. Rekombinantse tüve rakkude küllastunud biomassi kasvatamine tagab hübriidvalgu tootmise alguse, mille eraldamine ja järjestikune muundumine intubi abil viib insuliini. Teine uurijate rühm sai bakteriaalses ekspressioonisüsteemis fusioon rekombinantse valgu, mis koosnes inimese proinsuliinist ja polühistidiini sabast, mis oli selle külge kinnitatud metioniini jäägi kaudu. See isoleeriti, kasutades kelaat-kromatograafiat Ni-agaroosikolonnides inklusioonkehadest ja lõigati tsüanogeenbromiidiga. Autorid leidsid, et eraldatud valk on S-sulfureeritud. Saadud proinsuliini kaardistamise ja massispektromeetria analüüs, mis oli puhastatud ioonivahetuskromatograafiaga anioonivahetajal ja RP (pöördfaasiline) HPLC (kõrgsurvevedelikkromatograafia), näitas disulfiidsildade olemasolu, mis vastavad loodusliku inimese proinsuliini disulfiidsildadele. Aruandes kirjeldati ka uue, täiustatud meetodi väljatöötamist inimese insuliini saamiseks prokarüootsetes rakkudes geenitehnoloogia meetoditega. Autorid leidsid, et selle struktuuris ja bioloogilises aktiivsuses saadud insuliin on identne kõhunäärmest eraldatud hormooniga [5].

Hiljuti on pööratud suurt tähelepanu rekombinantse insuliini valmistamise korra lihtsustamisele geenitehnoloogia meetoditega. Seega saadi lüsiinijäägi abil fusioonvalk, mis koosnes proinsuliini N-otsa kinnitatud interleukiini liiderpeptiidist. Valk ekspresseeriti efektiivselt ja paiknes inklusioonikehades. Pärast isoleerimist lõhustati valk trüpsiiniga, et toota insuliini ja C-peptiidi. Teine uurijate rühm tegutses sarnaselt. Fusioonvalk, mis koosneb proinsuliinist ja Staphylococcus valgu A kahest sünteetilisest domeenist, mis seondub IgG-ga, lokaliseeriti inklusioonkehades, kuid neil oli kõrgem ekspressioonitase. Valk eraldati afiinsuskromatograafia abil, kasutades IgG ja töödeldi trüpsiini ja karboksüpeptidaasiga B. Saadud insuliin ja C-peptiid puhastati RP-HPLC abil. Fusioonistruktuuride loomisel on kandjavalgu ja sihtpolüpeptiidi massisuhe väga oluline. Nii kirjeldatakse sulandkonstruktide konstruktsiooni, kus kandjapolüpeptiidina kasutati inimese seerumi albumiini siduvat valku. Sellele lisati üks, kolm ja seitse C-peptiidi. C-peptiidid kombineeriti pea-saba alusel, kasutades aminohappe vaheühendeid, mis kannavad Sfi I restriktsioonisaiti, ja kaks arginiinijääki speisseri alguses ja lõpus, et järgnevat valgu lõhustamist trüpsiiniga. HPLC lõhustamissaadused näitasid, et C-peptiid lõhustatakse kvantitatiivselt ja see võimaldab kasutada multimeersete sünteetiliste geenide meetodit sihtmärk-polüpeptiidide tootmiseks tööstuslikus mastaabis.

Mutantse proinsuliini saamine, mis sisaldas Arg32Tyr asendamist. Selle valgu ühisel lõhustamisel trüpsiiniga ja karboksüpeptidaas B-ga moodustati looduslik insuliin ja türosiinijääki sisaldav C-peptiid. Viimast, pärast 125I märgistamist, kasutatakse aktiivselt radioimmunoanalüüsis [6].

Insuliini kvaliteedikontroll

Sisu

1. Üldine teave insuliini saamise kohta 5

2. Insuliini kvaliteedi kontrollimise meetodid 8

Viited 17

Väljavõte töölt

1-2% Euroopa elanikkonnast kannatab diabeedi all ja umbes 20% nendest patsientidest ei saa ilma insuliini süstideta. Alates esimestest katsetest insuliini kasutamise kohta diabeedi raviks 1922. aastal eraldati see hormoon loomade kõhunäärmest (lehmad ja sead). Loominsuliin erineb veidi iniminsuliini aminohappejärjestusest.

Inimeste ja sigade insuliinid on eriti lähedased: sigade insuliinis asendatakse B-ahela C-terminaalne treoniin alaniiniga. Lehm ja iniminsuliin erinevad kolme aminohappejäägi poolest. Need erinevused määrasid veiste insuliini suurenenud immunogeensuse aktiivsuse võrreldes sigade insuliiniga.

Peaaegu kõigil patsientidel, keda raviti lehmade insuliiniga, olid veres insuliinivastased antikehad. Insuliini antigeenseid omadusi määrati ka preparaatide lisandite abil. Tõenäoliselt selgus, et insuliini tekitanud antikehad tekitasid mõningaid kõrvaltoimeid, kui süstiti lehminsuliini, näiteks subkutaanse rasva atroofiat süstekohta. Kõrge puhtusega insuliini puhul puudusid need toimed.

Seejärel saadi geenitehnoloogia abil ja kasutades E. Coli, inimese insuliini.

E. coli abil saadud iniminsuliin oli esimene inimestel testitud "geneetiliselt muundatud" valk. Tervete vabatahtlike katsetes leiti, et see on ohutu (ei põhjusta allergilisi ja muid soovimatuid reaktsioone) ning on võimeline vähendama naha või intravenoosselt manustatava veresuhkru taset veres.

Praegu saadakse selline iniminsuliin paljudele diabeetikutele kogu maailmas. Sellele eelnesid kliinilised uuringud, mille käigus uuriti metaboolseid muutusi ja immunoloogilisi toimeid.

Meie teema asjakohasus on see, et kontrollimatu või halvasti kontrollitud tootmine võib viia saastunud insuliinipreparaatide vabanemiseni, mis omakorda võib põhjustada kahjulikke kliinilisi tagajärgi.

Selle töö eesmärk on uurida insuliini kvaliteedikontrolli meetodeid.

Viited

GOST R 52249-2004 "Ravimite tootmise ja kvaliteedi kontrollimise eeskirjad" 2004

OFS 42-0002-00 “Bakteriaalsed endotoksiinid” 2000

OFS 42-0126-09 "Insuliini bioloogiline testimine"

Venemaa Föderatsiooni farmakopöa artikkel FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Iniminsuliini geneetiline tehnika: edu ja väljavaated // Vene keemiaajakiri. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - lk 34-45.

Goncharenko G.G. Biotehnoloogia alused: õpetamismeetod. keeruline. eriline / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 lk.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Kineetilise-kromogeense meetodi rakendamine bakteriaalse endotoksiini (LAL-testi) määramiseks geneetiliselt muundatud iniminsuliini puhastamise tehnoloogias // Biofarmatseutiline ajakiri - 2009. - Vol. - №1. - lk 34-37.