Insuliini tootmise tehnoloogia

  • Ennetamine

Insuliin on üks inimorganismi ise toodetud hormoonidest, eriti kõhunäärmest. Selle aine sekretsiooni rikkumine toob kaasa sellise tõsise haiguse nagu diabeet. Selle raviks sünteetilise hormooni abil, mis pikka aega isoleeriti karjakasvandusest. Kuid insuliini tootmiseks kasutatavat tehnoloogiat väga tavalise bakteri - Escherichia coli või pärmseente abil - on kasutatud juba pikka aega. Selle meetodi kasutamine võimaldab teil vältida allergilisi reaktsioone, mis on põhjustatud võõrastest valkudest, millel on kerge erinevus inimesest.

Tehnoloogiline kava

Insuliini tootmistehnoloogia hõlmab kõiki biotehnoloogia toodete tootmise peamisi etappe. Tulemuseks on kristalne lõpptoode, mida seejärel kasutatakse I ja II tüüpi raske diabeedi raviks kasutatavate süstelahuste valmistamiseks. Selle hormooni peamine toime kehas avaldub veres sisalduva glükoosi taseme languses.

Insuliini tootmise etapid on järgmised:

  • Esialgne. Ta teostab selliseid toiminguid nagu vee ja õhu ettevalmistamine ja puhastamine, tööstuspindade puhastamine ning seadmete steriliseerimine, personali kontrollimine, käte töötlemine ja steriilsete kingade ja rõivaste väljastamine. Esialgses etapis valmistatakse ka nende molekulaarsete ahelate primaarne keemiline süntees, millest valk on kokku pandud. Kett A sisaldab 21 aminohappejääki ja ahel B sisaldab 30 aminohapet.
  • Toitelahuste ja rakukultuuri ettevalmistamine. Elava raku valmistamiseks tekib vajalik ühend, sisestatakse vastav geen. Selleks lõigatakse plasmiid spetsiaalsete ensüümide, piirangute ja vajalike ühendite sünteesi kodeerivate geenide külge. Seejärel, kasutades mikroinjektsioonimeetodit, viiakse modifitseeritud plasmiid tagasi rakku.
  • Rakususpensiooni kasvatamine. Geneetiliselt muundatud rakud paigutatakse toitainelahusesse, millel on kõik kasvuks ja paljunemiseks ning steriliseerimiseks vajalikud koostisosad. Kultuuri kasvatamine toimub erilistes bioreaktorites, kus eelnevalt puhastatud õhku söödetakse. Perioodiliselt lisatakse reaktorisse teatud kogus toitelahust ja samal ajal eemaldatakse sama kogus rakususpensiooni.
  • Kultuuri jaotamine. Vedeliku ja rakukultuuri eraldamine toimub sedimentatsiooniga (settimine) erilistes setetes ja seejärel filtrimisel, mis võimaldab säilitada rakkude terviklikkust.
  • Aine kromatograafiline puhastamine. See viiakse läbi sobival seadmel, kasutades erinevaid meetodeid, eriti frontaalset, anioonvahetust ja geeli läbilaskvuskromatograafiat.
  • Valgu molekuli saamine. Tegelikus biotehnoloogia staadiumis esineb tootmata insuliinimolekuli süntees. Ja selle kettide kaks komponenti. Need on õmmeldud pärast saadud ahelate oksüdeerimist ja voltimist, mille tulemuseks on disulfiidsildade moodustumine.
  • Külmkuivatamine spetsiaalses ahjus, mille tulemusena kontrollitakse saadud kristallpreparaadi vastavust standardile, pakendatakse, märgistatakse ja saadetakse tarbijale.

Meie ettevõte pakub soodsatel tingimustel valmis tootmisliine, kus on täielikult täidetud kogu insuliinitootmise tehnoloogia. Tänu täpsetele arvutustele, tehnilisele ja informatsioonilisele toetusele ning personali väljaõppele tervikliku programmi raames on ettevõte tulus ja selle tooted on nõudlikud.

Insuliini tüübid ja meetodid selle tootmiseks

1. Insuliini tüübid

2. Insuliini saamine

Insuliin (ladina keelest Insula-saar) on peptiidhormoon, mis moodustub Langerhani pankrease saarekeste beetarakkudes. See mõjutab metabolismi peaaegu kõikides kudedes.

Insuliini põhiülesanne on tagada glükoosimolekulide rakumembraanide läbilaskvus. Lihtsustatud vormis võib öelda, et mitte ainult süsivesikud, vaid ka kõik toitained jagunevad lõpuks glükoosiks, mida kasutatakse teiste süsinikku sisaldavate molekulide sünteesimiseks ja mis on ainus kütuseliik rakujaamadele - mitokondrid. Ilma insuliinita langeb rakumembraani läbilaskvus glükoosile 20 korda ja rakud surevad nälga ning veres lahustunud suhkru mürgib keha.

1. tüüpi suhkurtõve patogeneesi võtmetegur on beeta-rakkude hävimisest tingitud insuliini sekretsiooni kahjustus - absoluutne insuliinipuudus. Insuliini mõju koe - suhtelise insuliini puudulikkuse - rikkumisele on oluline koht II tüüpi diabeedi arengus.

Insuliini avastamise ajalugu on seotud Vene arsti I.M. nimega. Sobolev (19. sajandi teine ​​pool), kes tõestas, et suhkru taset inimveres reguleerib kõhunäärme eriline hormoon.

1922. aastal tutvustati loomade kõhunäärmest isoleeritud insuliini esmakordselt kümneaastasele diabeetikule. tulemus ületas kõik ootused ja aasta hiljem vabastas Ameerika firma Eli Lilly esimese loominsuliini preparaadi.

Pärast esimese tööstusliku insuliinipartii saamist on lähiaastatel läbinud suure tee selle eraldamiseks ja puhastamiseks. Selle tulemusena sai hormoon I tüüpi diabeediga patsientidele kättesaadavaks.

1935. aastal optimeeris Taani teadlane Hagedorn insuliini toimet kehas, pakkudes välja pikaajalist ravimit.

Esimesed insuliini kristallid saadi 1952. aastal ja 1954. aastal krüpteeris Inglise biokeemik G.Senger insuliini struktuuri. Meetodite väljatöötamine hormooni puhastamiseks teistest hormonaalsetest ainetest ja insuliini lagunemisproduktidest võimaldas saada homogeenset insuliini, mida nimetatakse ühekomponendiliseks insuliiniks.

70ndate alguses gg. Nõukogude teadlased A. Yudaev ja S. Shvachkin pakkusid välja insuliini keemilise sünteesi, kuid selle sünteesi rakendamine tööstuslikus mastaabis oli kallis ja kahjumlik.

Tulevikus paranes järk-järgult insuliinide puhastusaste, mis vähendas insuliinialergiate, neerufunktsiooni kahjustuse, nägemishäirete ja immuunsusinsuliini resistentsuse tekitatud probleeme. Kõige efektiivsem hormoon oli vajalik suhkurtõve asendusraviks - homoloogne insuliin, st iniminsuliin.

80-ndatel aastatel võimaldasid molekulaarbioloogia edusammud sünteesida mõlemad E. coli abil kasutatavad iniminsuliini ahelad, mis seejärel ühendati bioloogiliselt aktiivse hormoonimolekuliga, ning rekombinantse insuliini saadi Vene Teaduste Akadeemia Bioorgaanilise Keemia Instituudis, kasutades E. coli geneetiliselt muundatud tüvesid.

Afiinsuskromatograafia kasutamine vähendas oluliselt preparaadis olevate saastavate valkude sisaldust, mille molekulmass oli suurem kui insuliin. Selliste valkude hulka kuuluvad proinsuliin ja osaliselt lõhustatud proinsuliinid, mis on võimelised indutseerima antiinsuliini antikehade tootmist.

Iniminsuliini kasutamine ravi algusest vähendab allergiliste reaktsioonide esinemist. Iniminsuliin imendub kiiremini ja sõltumata ravimi vormist on toime lühem kui loominsuliin. Inimese insuliinid on vähem immunogeensed kui sealiha, eriti veiste ja sigade segud.

1. Insuliini tüübid

Insuliinipreparaadid erinevad puhastusastme poolest; saamise allikas (veis, siga, inimene); insuliini lahusele lisatud ained (selle toime pikendamine, bakteriostaatikumid jne); kontsentratsioon; pH väärtus; võimalus segada ICD-d SDI-ga.

Insuliinipreparaadid varieeruvad allika järgi. Siga ja veise insuliin erineb inimese aminohapete koostises: veis kolmest aminohappest ja sea ühest. Ei ole üllatav, et veiste insuliiniga ravimisel tekivad kõrvaltoimed palju sagedamini kui sigade või iniminsuliinidega ravimisel. Neid reaktsioone väljendatakse immunoloogilise insuliiniresistentsuse, insuliini allergia, lipodüstroofia (subkutaanse rasva muutus süstekohal) puhul.

Hoolimata veiste insuliini ilmsetest puudustest on seda maailmas veel laialdaselt kasutatud. Ja veel, immunoloogiliselt on veiste insuliini puudused ilmsed: mingil juhul ei ole soovitatav seda määrata patsientidele, kellel on äsja diagnoositud suhkurtõbi, rasedad naised või lühiajaline insuliiniravi, näiteks perioperatiivsel perioodil. Veiste insuliini negatiivseid omadusi säilitatakse ka juhul, kui neid kasutatakse segus sigadega, mistõttu ei tohiks nende kategooriate patsientide raviks kasutada ka segatud (sigade ja veiste) insuliini.

Iniminsuliini preparaadid keemilise struktuuri jaoks on täielikult identsed iniminsuliiniga.

Iniminsuliini saamiseks vajaliku biosünteetilise meetodi peamine probleem on lõppsaaduse täielik puhastamine kasutatud mikroorganismide ja nende metaboolsete toodete väikseimatest lisanditest. Uued kvaliteedikontrolli meetodid tagavad, et eespool nimetatud tootjate biosünteetiline iniminsuliin ei sisalda kahjulikke lisandeid; seega vastab nende puhastusaste ja glükoosi alandav efektiivsus kõige kõrgematele nõuetele ja on peaaegu samad. Mis tahes soovimatud kõrvaltoimed, sõltuvalt lisanditest, ei sisalda need ravimid insuliini.

Praegu kasutatakse meditsiini praktikas kolme tüüpi insuliini:

- lühikese ulatusega kiire toime algus;

- tegevuse keskmine kestus;

- pika toimimise aeglane mõju.

Tabel 1. Kaubanduslike insuliinipreparaatide omadused

Lühitoimeline insuliin (ICD) - regulaarne insuliin - on lühitoimeline kristalne tsink-insuliin, mis lahustub neutraalses pH-s, mille mõju areneb 15 minuti jooksul pärast subkutaanset manustamist ja kestab 5-7 tundi.

Esimene pikendatud insuliin (SDI) loodi 30ndate lõpus, nii et patsiendid said süstida harvemini kui ainult ICD kasutamisel, võimaluse korral üks kord päevas. Toimeaja pikendamiseks modifitseeritakse kõiki teisi insuliinipreparaate ja lahustatakse neutraalses keskkonnas suspensiooni. Need sisaldavad protamiini fosfaatpuhvris - protamiintsink-insuliin ja NPH (neutraalne protamiin Hagedorn) - NPH-insuliin või erinevad tsinkikontsentratsioonid atsetaatpuhvris - insuliin ultralente, lint, seitsmekümnendik.

Keskmise kestusega insuliinipreparaadid sisaldavad protamiini, mis on keskmine m. 4400, mis sisaldab rohkelt arginiini ja mis on saadud vikerforellist. Kompleksi moodustamiseks on vaja protamiini ja insuliini suhet 1:10. pärast subkutaanset manustamist hävitavad proteolüütilised ensüümid protamiini, võimaldades insuliini imenduda.

NPH-insuliin ei muuda sellega segatud regulatiivse insuliini farmakokineetilist profiili. NPH-insuliin on eelistatavam kui insuliinlint, mis on tavalise insuliini sisaldavate terapeutiliste segude keskmise kestuse komponent.

Fosfaatpuhvris moodustavad kõik insuliinid tsinkiga kergesti kristalle, kuid ainult veiste insuliini kristallid on piisavalt hüdrofoobsed, et tagada ultralentele iseloomuliku insuliini aeglane ja püsiv vabanemine. Tsinkinsuliini tsinkkristallid lahustuvad kiiremini, toime avaldub varem, toime kestus on lühem. Seetõttu ei ole ravimit ultralente, mis sisaldab ainult seainsuliini. Monokomponentset seainsuliini toodetakse insuliinisuspensiooni, insuliini neutraalse, insuliinisofaani, insuliinaminokinuriidi nime all.

Insuliinlint on 30% insuliini insuliini segu (amorfne insuliini sade tsinkioonidega atsetaatpuhvris, mille mõju hajub suhteliselt kiiresti) 70% insuliiniga ultralente (halvasti lahustuv kristalne tsinkinsuliin, millel on viivitatud algus ja pikaajaline toime). Need kaks komponenti annavad kombinatsiooni suhteliselt kiire imendumise ja stabiilse pikaajalise toimega, muutes insuliini lindi mugavaks terapeutiliseks aineks.

2. Insuliini saamine

Iniminsuliini võib valmistada neljal viisil:

1) täielik keemiline süntees;

2) kaevandamine inimese kõhunäärmest (mõlemad meetodid ei sobi ebaefektiivsuse tõttu: esimese meetodi ebapiisav areng ja teise meetodi abil masstootmise toorainete puudumine);

3) poolsünteetilise meetodiga, kasutades aminohappe alaniini B-ahela asendis 30 ensüüm-keemilist asendust seainsuliinis koos treoniiniga;

4) geenitehnoloogiate biosünteetiline meetod. Kaks viimast meetodit võimaldavad saada kõrge puhtusastmega iniminsuliini.

Praegu saadakse iniminsuliini peamiselt kahel viisil: sealiha insuliini modifitseerimisel sünteetilise ensümaatilise meetodiga ja geenitehnoloogia meetodil.

Insuliin oli esimene kaubanduslikul eesmärgil saadud rekombinantse DNA tehnoloogia abil saadud valk. Geneetiliselt muundatud iniminsuliini saamiseks on olemas kaks peamist lähenemisviisi.

Esimesel juhul toodavad eraldi (erinevad tootjate tüved) mõlemad ahelad, millele järgneb molekuli voltimine (disulfiidsildade moodustumine) ja isovormide eraldamine.

Teises, preparaadis prekursori (proinsuliini) vormis, millele järgneb ensümaatiline jaotumine trüpsiini ja karboksüpeptidaasiga B hormooni aktiivseks vormiks. Praegu on kõige eelistatumaks saada insuliin prekursorina, tagades disulfiidsildade õige sulgemise (ahelate eraldi tootmise korral viiakse läbi järjestikused denatureerimise tsüklid, isovormide eraldamine ja renaturatsioon).

Mõlemal juhul on võimalik nii individuaalselt saada lähtekomponente (A ja B ahelad või proinsuliin) kui ka hübriidvalkude osana. Lisaks A- ja B-ahelatele või proinsuliinile võib hübriidvalkude koostises esineda:

- valgu kandja, mis tagab hübriidvalgu transportimise raku või söötme periplasmaatilisse ruumi;

- afiinsuskomponent, mis suuresti hõlbustab hübriidvalgu valimist.

Samal ajal võivad mõlemad komponendid esineda samaaegselt hübriidvalgu koostises. Lisaks võib hübriidvalkude loomisel kasutada mitmemõõtmelisuse põhimõtet (see tähendab, et hübriidvalgus on mitu sihtmärk-polüpeptiidi koopiat), mis võimaldab märksa produkti saagist oluliselt suurendada.

Ühendkuningriigis sünteesiti mõlemad iniminsuliini ahelad kasutades E. coli, mis seejärel ühendati bioloogiliselt aktiivse hormoonmolekuliga. Selleks, et üheahelaline organism sünteesiks insuliinimolekule oma ribosoomidel, on vaja seda varustada vajaliku programmiga, st hormoongeeni sisestamisega.

Keemiliselt saadakse insuliini geeniprogrammi biosünteesi prekursor või kaks geeni, programmeerides eraldi insuliinikettide A ja B biosünteesi.

Järgmine etapp on insuliini prekursori (või ahela geenide) geeni lisamine E. coli genoomi, mis on eriline E. coli tüvi, mida kasvatatakse laboritingimustes. Seda ülesannet teostab geenitehnoloogia.

Plasmiid eraldatakse E. coli'st vastava restriktsiooniensüümi abil. Sünteetiline geen sisestatakse plasmiidi (kloonimine P-galaktosidaasi E. coli funktsionaalselt aktiivse C-terminaalse osaga). Selle tulemusena omandab E.coli võime sünteesida valgu ahelat, mis koosneb galaktosidaasist ja insuliinist. Sünteesitud polüpeptiidid lõhustatakse ensüümist keemiliselt ja seejärel puhastatakse. Bakterites sünteesitakse bakteriraku kohta umbes 100 000 insuliinimolekuli.

E. coli poolt toodetud hormooni aine olemus määratakse kindlaks, milline geen on sisestatud üheahelalise organismi genoomi. Kui insuliini prekursori geen kloonitakse, sünteesib bakter insuliini prekursorit, mis seejärel allutatakse restriktsiooniensüümi töötlusele, et eemaldada eelsoodumus C-peptiidi eraldamisega, mille tulemuseks on bioloogiliselt aktiivne insuliin.

Puhastatud humaaninsuliini saamiseks viiakse biomassist eraldatud hübriidvalk keemilis-ensümaatilisele transformatsioonile ja vastavale kromatograafilisele puhastamisele (primaarne, geeli läbitav anioonvahetus).

Rekombinantne insuliin saadi RAS-i instituudis, kasutades geneetiliselt muundatud E. coli tüvesid. Eelkäija, hübriidvalk, mis on väljendatud 40% ulatuses kogu raku valgust, mis sisaldab preproinsuliini, vabaneb kasvatatud biomassist. Selle muundumine insuliiniks in vitro toimub samas järjestuses nagu in vivo - juhtiv polüpeptiid lõhustatakse, preproinsuliin muudetakse oksüdatiivsete sulfitolüüsi etappidena insuliiniks, millele järgneb kolme disulfiidsideme redutseeriv sulgemine ja C-peptiidi sidumise ensümaatiline eraldamine. Pärast mitmeid kromatograafilisi puhastusi, kaasa arvatud ioonvahetus, geel ja HPLC, saadakse inimese kõrge puhtusastmega ja loodusliku aktiivsusega insuliin.

Võib kasutada tüve, millel on fusioonvalku ekspresseeriv plasmiidiga varustatud nukleotiidjärjestus, mis koosneb lineaarsest proinsuliinist ja Staphylococcus aureus proteiinifragmendist A, mis on kinnitatud selle N-otsa külge.

Rekombinantse tüve rakkude küllastunud biomassi kasvatamine tagab hübriidvalgu tootmise alguse, mille eraldamine ja järjestikune transformatsioon tuubis viib insuliini.

Võimalik on ka teine ​​võimalus: bakteriaalses ekspressioonisüsteemis ilmneb fusioon rekombinantne valk, mis koosneb inimese proinsuliinist ja selle külge kinnitatud polühistidiini sabast metioniini jäägi kaudu. See isoleeritakse, kasutades kelaat-kromatograafiat Ni-agaroosi kolonnidel inklusioonikehadest ja digereeritakse tsüanogeenbromiidiga.

Eraldatud valk on S-sulfoonitud. Saadud proinsuliini kaardistamine ja massispektromeetriline analüüs, mis on puhastatud ioonivahetuskromatograafiaga anioonivahetusel ja RP (pöördfaasi) HPLC-l (kõrgsurvevedelikkromatograafia), näitavad disulfiidsildade olemasolu, mis vastavad natiivse inimese proinsuliini disulfiidsildadele.

Hiljuti on pööratud suurt tähelepanu rekombinantse insuliini valmistamise korra lihtsustamisele geenitehnoloogia meetoditega. Näiteks on võimalik saada fusioonvalk, mis koosneb interleukiini 2 liiderpeptiidist, mis on kinnitatud proinsuliini N-otsa lüsiinijäägi kaudu. Valk ekspresseeritakse efektiivselt ja paikneb inklusioonkehades. Pärast isoleerimist lõhustatakse valk trüpsiiniga, et toota insuliini ja C-peptiidi.

Saadud insuliin ja C-peptiid puhastati RP HPLC abil. Fusioonistruktuuride loomisel on kandjavalgu ja sihtpolüpeptiidi massisuhe väga oluline. C-peptiidid on ühendatud pea-saba põhimõttega, kasutades aminohappevahendeid, mis kannavad Sfi I restriktsioonisaiti ja kahte arginiinijääki speisseri alguses ja lõpus, et järgnevaks valguks lõhustada trüpsiiniga. HPLC lõikamissaadused näitavad, et C-peptiidi lõhustamine on kvantitatiivne ja see võimaldab kasutada multimeersete sünteetiliste geenide meetodit, et saada sihtmärk-polüpeptiide tööstuslikus mastaabis.

Suhkurtõbi on krooniline haigus, mida põhjustab absoluutne või suhteline insuliinipuudus. Seda iseloomustab süsivesikute sügav metaboolne häire, millel on hüperglükeemia ja glükosuuria, samuti mitmed geneetilised ja välised tegurid.

Seni on insuliin radikaalne ja enamikul juhtudel ainus viis diabeediga inimeste elu ja puude säilitamiseks. Enne insuliini saamist ja manustamist kliinikusse 1922-1923. I tüüpi diabeediga patsiendid ootasid letaalset tulemust ühe kuni kahe aasta jooksul alates haiguse algusest, hoolimata kõige nõrgema toitumise kasutamisest. I tüüpi suhkurtõvega patsiendid vajavad insuliiniga elukestvat asendusravi. Insuliini regulaarse sissetoomise erinevatel põhjustel lõppemine põhjustab komplikatsioonide kiiret arengut ja patsiendi peatset surma.

Praegu on diabeedi levimus kardiovaskulaarsete ja onkoloogiliste haiguste järel 3. kohal. Maailma Tervishoiuorganisatsiooni andmetel on enamiku maailma piirkondade diabeedi levik täiskasvanud elanikkonna seas 2-5% ja on kalduvus suurendada patsientide arvu peaaegu kaks korda iga 15 aasta järel. Hoolimata ilmsest edusammudest tervishoiu valdkonnas suureneb insuliinisõltuvate patsientide arv igal aastal ja praegu on Venemaal ainult umbes 2 miljonit inimest.

Inimese geneetilise insuliini ravimite loomine avab uusi võimalusi paljude diabeetoloogia probleemide lahendamiseks Venemaal, et päästa miljoneid diabeediga inimeste elu.

Biotehnoloogia: õpik keskkoolidele / toim. N.S. Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Kõrgkool, 1987, lk 15-25.

Geneetilise inseneri iniminsuliin. Kromatograafilise eraldamise tõhususe parandamine, kasutades bifunktsionaalsuse põhimõtet. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S. A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, nr 2

Glick B., Pasternak J. Molekulaarne biotehnoloogia. Põhimõtted ja kohaldamine. M: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Mikroorganismide tööstuslike tüvede loomise kaasaegsed meetodid // Biotehnoloogia. Prince 2. M.: Kõrgkool, 1988. 208 lk.

Trüpsiini ja karboksüpeptidaasi B immobiliseerimine modifitseeritud ränidioksiidile ja nende kasutamine rekombinantse inimese proinsuliini muundamiseks insuliiniks. / Kudryavtseva N. E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I, Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Keemilised ravimid. J., 1995 - 29, nr 1, lk 61-64.

Molekulaarbioloogia. Valkude struktuur ja funktsioon / Stepanov V. M. / / Moskva, keskkool, 1996.

Farmatseutilise biotehnoloogia alused: uuringu juhend / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-on-Don: Phoenix; Tomsk: kirjastus NTL, 2006.

Insuliinifragmentide süntees ja nende füüsikalis-keemiliste ja immunoloogiliste omaduste uurimine. / Panin L. E., Tuzikov F. V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997–23, nr 12, lk 953–960.

Insuliini geneetiliselt muundatud meetodi tootmise eeskirjad

Avaleht> Ettekanne> Meditsiin, tervis

Riiklik haridusasutus

kõrgharidus

Kurski Riiklik Meditsiiniülikool

Föderaalne tervishoiu- ja sotsiaalarengu agentuur

Farmaatsiatehnoloogia osakond

geneetiliselt muundatud insuliini saamiseks rDNA biotehnoloogia abil

5. aasta õpilane 5 gruppi

Ph.D., vanemteadur Maravina I.N.

I jagu. Lõpptoote omadused 3

II jagu. Tooraine omadused 5

III jagu. Keemilise tootmise kava 6

IV jagu. Tootmistehnoloogiline kava 7

V jagu. Tootmise vooskeem ja spetsifikatsioon

VI jagu. Protsessi avaldus 10

VII jagu. Analüüsimeetodid 14

VIII jagu. Ohutus, tuleohutus,

tööstuslik sanitaartehnika 16

IX jagu. Tootmisjuhiste loetelu 17

I jagu. Lõpptoote omadused

Kuiv insuliinbiomass

Kirjeldus. Insuliinilahused on läbipaistev, värvitu või kergelt kollakas happeline vedelik (pH 2,0–3,5), mis valmistatakse vesinikkloriidhappega hapestatud vees lahjendades glütserooli ja 0,25–0,30% fenooli või trikresooli lahust. konserveerimiseks.

Hüpoglükeemiline aine, lühitoimeline insuliin. Koostoime spetsiifilise retseptoriga rakkude välismembraanis ja moodustab insuliiniretseptori kompleksi. CAMP biosünteesi aktiveerimisel rasvarakkudes ja maksarakkudes või otseselt tungides lihasrakkudesse stimuleerib insuliiniretseptorite kompleks intratsellulaarseid protsesse, sealhulgas mitmete oluliste ensüümide (heksokinaas, püruvaadi kinaas, glükogeeni süntetaas jne) süntees. Vere glükoosisisalduse vähenemine on tingitud selle intratsellulaarse transpordi suurenemisest, suurenenud imendumisest ja imendumisest kudedes, lipogeneesi stimuleerimisest, glükogenogeneesist, valgu sünteesist, maksa glükoositoodangu vähenemisest jne. tegurid (annusest, meetodist ja süstekohast). Pärast p / kuni toime alguseni - 0,5 tunni pärast - maksimaalne toime - 1-3 tunni pärast, toimimise kestus - 8 tundi.

1. tüüpi suhkurtõbi (insuliinsõltuv). 2. tüüpi suhkurtõbi (insuliinisõltumatu): suukaudsete hüpoglükeemiliste ravimite resistentsuse staadium, osaline resistentsus nende ravimite suhtes (kombinatsioonravi ajal), vahelduvad haigused, rasedus.

Ravi alguses - nägemishäired, jäsemete turse. Liiga suurte insuliiniannuste kasutamisega või dieedi rikkumisega (söögi vahelejätmine), samuti liigse treeningu, hüpoglükeemia (külm higi, kahvatu nahk, närvilisus, treemor, ärevus, liigne väsimus või nõrkus, desorientatsioon, pearinglus, peavalu, väljendunud nälja tunne, ajutine nägemishäired, iiveldus, tahhükardia, rasketel juhtudel - teadvuse kaotus, kooma). Süsteemsed allergilised reaktsioonid: suurenenud higistamine, oksendamine, hingamisraskused, südamepekslemine, pearinglus.

Kõlblikkusaeg - 1 aasta alates valmistamiskuupäevast.

II jagu. Tooraine omadused

Kettide A ja B sünteesi kodeerivate geenide ahelad

Keemiliselt sünteesitud

Kultuur peab olema puhas

Neljakihilised paberkotid

Kangad puuvillase ribaga

III jagu. Keemilise tootmise kava

Keemilised muundumised geneetiliselt muundatud insuliini tootmisel puuduvad.

IV jagu. Insuliini tootmise tehnoloogiline skeem

Ruumide ja seadmete ettevalmistamine

Sanitaartöötlemise tootmine

Tehnoloogiliste rõivaste valmistamine

Kettide A ja B süntees

Geenide sisestamine plasmiidi

R-DNA sisestamine lubavasse rakku

Toitainete valmistamine

Kultiveerimissuspensiooni kultuur

Insuliinimolekuli saamine

FS näitajate kohaselt

Instrumentaalne tootmiskava ja seadmete spetsifikatsioon

1 - Keemiline reaktor

2 - Geenide sisestamine plasmiidi

4 - Pidev steriliseerimisüksus

5 - Tööstuslik bioreaktor

6 - Kettide valik

7 - Kromatograafiline paigaldus

8 - insuliinimolekuli saamine

9 - Kuivati ​​külmutamine

10 - Analüütiline tabel

VI jagu. Protsessi kirjeldus

BP 1. Vee ettevalmistamine

Membraani destilleerijad on valmistatud selliselt, et saadakse soolane vesi, mis vastab GOST 6709-97 "Destilleeritud vesi" nõuetele. Destilleerijate tootlikkus - 3–15 l / tunnis (laboriseadmed majanduslikult täielikus komplektis) ja ka 5-30 l / h (laboriseadmed). Filtreerimisprotsess hõlmab järgmisi etappe: aktiivsöe eeltöötlemine, membraanfiltreerimine ja vee deioniseerimine ioonivahetusvaikude abil. Eelfilter eemaldab sissetulevast kraaniveest suspendeeritud osakesed, kloori, kõrgmolekulaarsed orgaanilised ained ja raskemetallide ioonid. Membraanfiltratsioon põhineb pöördosmoosi fenomenil, kus vesi, mis läbib poolläbilaskva membraani, puhastatakse selles lahustunud sooladest, madala molekulmassiga orgaanilistest lisanditest, samuti bakteritest ja mikroorganismidest. Ioonivahetusvaiguga filtril puhastatakse filtraat täielikult lahustunud sooladest.

BP 2. Tootmise sanitaartöötlus.

BP 2.1. Steriilse annustamisvormi valmistamiseks on ruumides esitatud järgmised nõuded: t

Tuleb hoida laitmatut puhtust, tingimusel, et see on kohustuslik iga päev, samuti üldine puhastamine ja perioodiline remont;

Võib kokku puutuda UV-kiirgusega, et õhu desinfitseerimiseks kasutada statsionaarset või kaasaskantavat kiirgust;

Peab olema valgustus, temperatuur, niiskus ja ventilatsioon, millel ei ole otsest ega kaudset negatiivset mõju valmistoodete kvaliteedile;

Peab sisaldama tootmisprotsessi läbiviimiseks vajalikku minimaalset varustust ja mööblit;

Seinte, põranda ja lae vaheline paaritumine peab olema ümardatud;

I ja II klassi puhtusruumides ei tohiks olla avatud sidet, õhukanaleid;

Kõrgema puhtusastmega ruumid peaksid asuma madalama puhtusastmega ruumis. Töötajate ja toorainete ligipääs puhtale ruumile toimub ainult õhuväravate kaudu, mis on varustatud steriilse õhuga vastavalt ülalt-alla skeemile;

Lõpptoote ülekandmine peab toimuma läbi seinte läbiva konveieri.

BP 2.2. Seadmete ettevalmistamine

Nõuded seadmete ettevalmistamisele:

Seadmed peavad olema projekteeritud ja paigaldatud nii, et selle toimimist, hooldust ja remonti saab teostada väljaspool „puhtaid” ruume;

Aseptilistes tingimustes töötamiseks kasutatavatel seadmetel peab olema salvestusseadmed protsessi parameetrite jälgimiseks ja häireseadmete olemasolu korral selle rikke korral;

Seadmed tuleb puhastada, desinfitseerida ja vajadusel steriliseerida;

Seadmeid tuleb jälgida mikrobioloogilise puhtuse suhtes;

Seadme tööpind peaks olema mürgistest ja mittesöövitavatest materjalidest sile.

BP 2.3. Töötajate koolitus

Nõuded töötajatele:

Personal peab omama teatavaid minimaalseid teadmisi hügieeni-, sanitaar- ja hea tootmistava eeskirjade kohta;

Nakkushaigustega töötajad, naha avatud haavad ja patogeensete mikrofloora kandjad ei tohi töötada;

On keelatud rääkida, süüa, liikuda kiiresti töökohal;

Järgige rangelt isiklikku hügieeni, eemaldage kosmeetikavahendid näost ja eemaldage ehted enne "puhtasse" ruumi sisenemist;

Võtke dušš, peske ja puhastage oma käed desinfektsioonivahenditega, asetage steriilsetele tehnoloogilistele rõivastele ja kingadele.

BP 3. Kettide A ja B süntees

Kettide süntees viiakse läbi keemilise meetodiga. Kett A sisaldab 21 aminohappejääki, Chain B - 30 jääke

BP 4. Geenide sisestamine plasmiidi.

Selleks, et plasmiid aktsepteeriks võõrgeeni, lõigatakse selle ahel restriktsiooniensüümidega. Kettide A ja B sünteesi kodeerivate geenide ühendamiseks kasutatakse eri pikkusega oligosahhariidijääke - linkereid ja adaptereid. Kui molekul on suletud, saate selle sisestada lubatavasse lahtrisse.

BP 5. R-DNA sisestamine lubavasse rakku.

P = DNA sisestamine E. coli rakku viiakse läbi mikroinjektsiooni teel: plasmiidi sisaldav vektori DNA sisestatakse E.coli rakku spetsiaalse ultrathin klaasnõelaga.

TP 6. Toitekeskkonna valmistamine

E. coli kultuuri kasvatamiseks on peamiseks toiteaineks Milleri järgi puljong. Koostis: kaseiini hüdrolüsaat, pärmiekstrakt, naatriumkloriid, agar-agar. Lõplik pH väärtus (25 ° C juures) on 7,0 ± 0,2, samuti kasutatakse Hottingeri puljongit. Koostis: Hottingeri hüdrolüsaat, naatriumkloriid, destilleeritud vesi.

Toitekeskkonna steriliseerimine toimub pideva steriliseerimise masinas - ONS. Toitekeskkond läbib järjest läbi kuumutussektsiooni, hoidesektsiooni ja jahutussektsiooni.

TP 7. Suspensioonikultuuri kasvatamine

Biokultuuride kultiveerimine toimub bioreaktorites, mille suspensioonikultuur segatakse õhuvoolu tõttu bioreaktorisse. Protsess viiakse läbi poolperioodilises režiimis, kui bioreatorile lisatakse pidevalt teatud kogust värsket toitainet ja samal ajal võetakse sama kogus rakususpensiooni.

TP 8. Kudekultuuri isoleerimine.

Kudekultuuri eraldamine toitekeskkonnast toimub settimismeetodil setete moodustamisel, sügavam eraldamine toimub õrna meetodi filtreerimisega, et säilitada kultuurirakkude terviklikkus.

Insuliin puhastatakse kromatograafia meetoditega: frontaalne, geeli läbilaskvus, anioonivahetus. Insuliini ja selle derivaatide puhastamist tugevate katioonvahetusomadustega sorbentidega (näiteks SP-Sepharose FF) võib kasutada ammooniumatsetaadil põhinevate puhversüsteemidega, mille karbamiidisisaldus on madal (kuni 2 M või vähem).

TP 10. Insuliinimolekuli saamine

Valitud ja puhastatud ahelad on volditud ja oksüdeeritud, mis tagab sobivate disulfiidsildade moodustumise.

Toote kuivatamine toimub külmkuivatis.

TP 12. Valmistoote kvaliteedi hindamine.

Välimus (kirjeldatud), aktiivsus (bioloogiline meetod).

UMO 13. Pakendamine, märgistamine, vedu.

Insuliini aktiivsust mõõdetakse toimepunktides (ED) või rahvusvahelistes toimingutes (IU - vene või IU - inglise või UI - prantsuse keeles). 1 ühik vastab 1/24 mg (41,66 μg) kristalse insuliini aktiivsusele.

1922. aastal tegi Frederick Banting ettepaneku, et insuliinitoimeühikut tuleks pidada kõhunäärme ekstrakti kuupmeetrite arvuks, mis tõi tervisliku küüliku hüpoglükeemiale, mille SC tase oli 2–4 tundi SC-tasemega 2,5 mmol / l. Veidi hiljem samal aastal tegi sama meeskond „hiire“ üksuse - insuliinikoguse, mis oli vajalik selleks, et viia pool katserühma hiirtest krampidele (siin tegutsesid uurijad algselt analoogiliselt LD50-ga).

Järgmisel aastal võttis Rahvusvaheline Standardikomitee vastu insuliinitoimeühiku määratluse: "Insuliini kogus, mis on vajalik veresuhkru taseme alandamiseks tasemele, mille puhul krambid algavad 2 kg kaaluvatel küülikutel, kes ei saa toitu 24 tunni jooksul." See üksus, Bantingi ja Besti Toronto grupi auks, sai nimeks Toronto insuliini üksuse.

1925. aastal võeti kasutusele esimene rahvusvaheline standard, mis näitas, et üks insuliini toime ühik on kogus, mis vastab 1/8 mg kristalsele insuliinile.

Tänu insuliini puhastamise suurtele edusammudele ja ebamugavusele sellise suure üksuse kasutamisel 1936. aastal kiitis Rahvaste Liiga komitee heaks uue rahvusvahelise standardi insuliinitoime kohta, mis võrdus ühikuga 1/22 mg kristalse insuliiniga. 1952. aastal muudeti standardit uuesti ja 1 ühik võrdus 1 / 24,5 mg kristallilise insuliiniga ja 1958. aastal ilmus lõpuks neljas standard (1 U on võrdne 1/24 mg kristalse insuliiniga). WHO 1982. aastal tegi standardi viimased kohandused, mis ei mõjutanud üksuse määratlust, vaid puudutasid ainult inimese geneetiliselt muundatud insuliini tekkega seotud muutusi.

VIII jagu. Ohutus, tuleohutus ja

Iga töövõtja ja inseneritöö peab töö saamisel läbima esmase juhendamise. Esmane juhendamine toimub meister või kapten järgmises programmis:

Töökaitse, tööohutuse, tööstusliku kanalisatsiooni õigusaktide põhisätted;

Erirõivaste ja isikukaitsevahendite kasutamise eesmärk ja kord;

Tööülesanded;

Nõuded töökoha nõuetekohaseks korraldamiseks ja hooldamiseks;

Üldised elektriohutuse eeskirjad, ventilatsiooni väärtus ja ventilatsioonisüsteemide kasutamise eeskirjad;

Tutvumine tehnoloogilise protsessi, seadmete ja kõigi ohtlike objektidega.

Kõik elektriseadmed peavad vastama elektriseadmete kasutamise reeglitele. Elektriseadmed peavad olema maandatud. Kõik tootmis- ja kasulikud ruumid, sisseseade, rajatised peavad olema varustatud tulekustutusseadmete ja tuletõrjevahenditega.

Loata isikute lubamine kauplusesse on keelatud.

IX jagu. Tootmisjuhiste loetelu

Tööjuhised ruumide sanitaarravi kohta.

Ohutus-, tööstus- ja tuleohutuse juhised.

Seadmete remondi ettevalmistamise, tarnimise ja vastuvõtmise juhised.

Juhised toorainete ja abimaterjalide vastuvõtmiseks;

Õnnetuste kõrvaldamise kava.

Lahenduse regenereerimise juhised.

Tööjuhendid pudelite pesemise, kuivatamise ja steriliseerimise kohta.

Juhendid torustike remondi ja hoolduse mehaanika kohta.

Insuliini tootmise tehnoloogia

Insulin.docx

1. peatükk. Kirjanduse ülevaade

1.3. Süstlad, ampullsüstlad ja insuliinid

1.4 Insuliini süstimise tehnika ……………………………………...

Insuliini imendumist ja toimet mõjutavad tegurid.........

1.6. Insuliinravi tüsistused ……………………………………..

1.7. Insuliini pakend

1.8. Insuliini säilitamine.

1.9. Kaasaegsed viisid insuliinravi parandamiseks.....

Peatükk 2. Eksperimentaalne osa

Pankrease Langerhans'i saarekeste beetarakkudesse moodustub insuliin (ladina keelest Insula - saar) - peptiidhormoon. See mõjutab metabolismi peaaegu kõikides kudedes.

Insuliini põhiülesanne on tagada glükoosimolekulide rakumembraanide läbilaskvus. Lihtsustatud vormis võib öelda, et mitte ainult süsivesikud, vaid ka kõik toitained jagunevad lõpuks glükoosiks, mida kasutatakse teiste süsinikku sisaldavate molekulide sünteesimiseks ja mis on ainus kütuseliik rakujaamadele - mitokondrid. Ilma insuliinita langeb rakumembraani läbilaskvus glükoosile 20 korda ja rakud surevad nälga ning veres lahustunud suhkru mürgib keha.

1. tüüpi suhkurtõve patogeneesi võtmetegur on beeta-rakkude hävimisest tingitud insuliini sekretsiooni kahjustus - absoluutne insuliinipuudus. Insuliini mõju koe - suhtelise insuliini puudulikkuse - rikkumisele on oluline koht II tüüpi diabeedi arengus.

Diabeediga inimeste arv maailmas on 120 miljonit (2,5% elanikkonnast). Iga 10-15 aasta järel kahekordistub patsientide arv. Rahvusvahelise diabeedi instituudi (Austraalia) andmetel on maailmas 2010. aastaks 220 miljonit patsienti. Ukrainas on umbes I miljonit patsienti, kellest 10-15% kannatab kõige raskema insuliinisõltuva diabeedi all (tüüp I). Patsientide arv on varjatud diagnoosimata vormide tõttu 2-3 korda suurem.

Insuliini avastamise ajalugu on seotud Vene arsti I.M. nimega. Sobolev (19. sajandi teine ​​pool), kes tõestas, et suhkru taset inimveres reguleerib kõhunäärme eriline hormoon.

1922. aastal tutvustati loomade kõhunäärmest isoleeritud insuliini esmakordselt kümneaastasele diabeetikule. tulemus ületas kõik ootused ja aasta hiljem vabastas Ameerika firma Eli Lilly esimese loominsuliini preparaadi.

Pärast esimese tööstusliku insuliinipartii saamist on lähiaastatel läbinud suure tee selle eraldamiseks ja puhastamiseks. Selle tulemusena sai hormoon I tüüpi diabeediga patsientidele kättesaadavaks.

1935. aastal optimeeris Taani teadlane Hagedorn insuliini toimet kehas, pakkudes välja pikaajalist ravimit.

Esimesed insuliini kristallid saadi 1952. aastal ja 1954. aastal krüpteeris Inglise biokeemik G.Senger insuliini struktuuri. Meetodite väljatöötamine hormooni puhastamiseks teistest hormonaalsetest ainetest ja insuliini lagunemisproduktidest võimaldas saada homogeenset insuliini, mida nimetatakse ühekomponendiliseks insuliiniks.

70ndate alguses gg. Nõukogude teadlased A. Yudaev ja S. Shvachkin pakkusid välja insuliini keemilise sünteesi, kuid selle sünteesi rakendamine tööstuslikus mastaabis oli kallis ja kahjumlik.

Tulevikus paranes järk-järgult insuliinide puhastusaste, mis vähendas insuliinialergiate, neerufunktsiooni kahjustuse, nägemishäirete ja immuunsusinsuliini resistentsuse tekitatud probleeme. Kõige efektiivsem hormoon oli vajalik suhkurtõve asendusraviks - homoloogne insuliin, st iniminsuliin.

80-ndatel aastatel võimaldasid molekulaarbioloogia edusammud sünteesida mõlemad E. coli abil kasutatavad iniminsuliini ahelad, mis seejärel ühendati bioloogiliselt aktiivse hormoonimolekuliga, ning rekombinantse insuliini saadi Vene Teaduste Akadeemia Bioorgaanilise Keemia Instituudis, kasutades E. coli geneetiliselt muundatud tüvesid.

Minu töö eesmärk: meie turul esitatud insuliinipreparaatide uuring, nende eelised ja puudused.

Ülesanded: Insuliini tööstuslikus tootmises hankimise protsessi kaalumine.

1. peatükk. Kirjanduse ülevaade

1.1 Insuliini saamine

Iniminsuliini võib valmistada neljal viisil:

1) täielik keemiline süntees;

2) kaevandamine inimese kõhunäärmest (mõlemad meetodid ei sobi ebaefektiivsuse tõttu: esimese meetodi ebapiisav areng ja teise meetodi abil masstootmise toorainete puudumine);

3) poolsünteetilise meetodiga, kasutades aminohappe alaniini B-ahela asendis 30 ensüüm-keemilist asendust seainsuliinis koos treoniiniga;

4) geenitehnoloogiate biosünteetiline meetod. Kaks viimast meetodit võimaldavad saada kõrge puhtusastmega iniminsuliini.

Kaaluge insuliini biosünteesi selle meetodi eeliste seisukohalt.

Niisiis, kasulikkus insuliini biosünteetiliselt.

Enne insuliini tootmiseks kasutatava meetodi kasutuselevõttu rekombinantsete mikroorganismide abil oli ainult üks viis insuliini saamiseks - veiste ja sigade pankrease näärmetest. Veise kõhust saadud insuliin erineb iniminsuliinist 3 aminohappejäägiga ja sigade näärmest saadud insuliin on ainult üks aminohappejääk, see tähendab, et see on lähemal iniminsuliinile. Kuid selliste valkude sisseviimisega, mis erinevad inimese valkude struktuurist, võivad isegi sellisel väikesel ekspressioonil tekkida allergilised reaktsioonid. Sellised insuliinid võõrvalguna võivad olla saadud veres ka inaktiveeritud.

Lisaks on vaja 1 kg insuliini saamiseks 35 000 siga (kui on teada, et iga-aastane insuliinivajadus on 1 tonni ravimit). Teisest küljest võib sama koguse insuliini saada biosünteesi teel 25 kuupmeetri fermenteris, kasutades rekombinantset mikroorganismi Escherichia coli.

Insuliini saamise biosünteetilist meetodit rakendati 80ndate alguses

Räägime rekombinantse insuliini tootmise skeemist (Eli Lilli- Eli-Lilly, Ameerika Ühendriigid):

1. etapp. Keemilise sünteesi abil loodi nukleotiidjärjestused, mis kodeerivad A- ja B-ahelate moodustumist, st sünteetilised geenid.

2. etapp. Iga sünteetiline geen sisestatakse plasmiidi (geeni sünteesiv ahel A sisestatakse ühte plasmiidi ja teise plasmiidi sisestatakse geeni sünteesiv ahel B).

3. etapp. Sisestage geen, mis kodeerib betagalaktosidaasi ensüümi moodustumist. See geen lisatakse igasse plasmiidi, et saavutada plasmiidide tugev replikatsioon.

4. etapp. Plasmiidid viiakse Escherichia coli rakku - Escherichia coli ja kaks tootja kultuuri, üks kultuur sünteesib A-ahelat, teist B-ahelat.

5. etapp. Asetage kaks kultuuri fermenterisse. Kolmapäeval lisage galaktoos, mis indutseerib ensüümi betagalaktosidaasi moodustumist. Sellisel juhul replitseeruvad plasmiidid aktiivselt, moodustades plasmiidide palju koopiaid ja seega palju geene, mis sünteesivad A- ja B-ahelaid.

6. etapp. Rakud lüüsivad, eritavad A- ja B-ahelaid, mis on seotud betagalaktosidaasiga. Kõiki neid töödeldakse tsüaanbromiidiga ja A- ja B-ahelad lõhustatakse beeta-galaktosidaasist. Seejärel tehke A- ja B-ahelate edasine puhastamine ja valik.

7. etapp. Tsüsteiinijäägid oksüdeeritakse, seonduvad ja insuliin valmistatakse.

Sellel teel saadud insuliin on selle struktuuris iniminsuliin, mis ravi algusest alates vähendab allergiliste reaktsioonide esinemist.

Puhastatud inimese insuliini saamiseks viiakse biomassist eraldatud hübriidvalk keemilis-ensümaatilisele transformatsioonile ja sobivale kromatograafilisele puhastamisele (eesmine, geeli läbitav, anioonvahetus).

Vene Teaduste Akadeemia instituudis saadi rekombinantne insuliin, kasutades geneetiliselt muundatud E. coli tüvesid, meetod seisneb proinsuliini bioloogilise prekursori sünteesis, mis võimaldab A- ja B-insuliini eraldi ahelate sünteesi mitte läbi viia. Molekuli pro-insuliiniosa tootmiseks E. colis. sisestatakse plasmiid (see saadakse loodusliku või võõr-DNA sisestamisega - see on nii, et saadakse rekombinantse RNA molekul). Plasmiid näeb ette rekombinantse valgu, mis on valgu liiderjärjestuse ja fragmendi, sünteesi, samuti inimese proinsuliini metioniini jäägiga (aminohape) nende vahel. Molekuli proinsuliiniosa eraldatakse töötlemisel äädikhappes broomi tsüaaniga (lõhustamine viiakse läbi selektiivselt - metioniinijäägi abil). Segu (proinsuliini osa ja liiderjärjestus) eraldatakse kromatograafiaga. Järgmises etapis, saadud proinsuliini järjestuses, viiakse läbi ahelate A ja B õige vastastikune paigutus, mida teostab keskosa - peptiid C. Järgmises etapis eraldatakse siduv C-peptiid ensümaatilise meetodiga. Pärast mitmeid kromatograafilisi puhastusi, kaasa arvatud ioonivahetus, geel ja HPLC, saadakse kõrge puhtusastmega inimese insuliin ja loomulik aktiivsus.

Geneetiliselt muundatud insuliini kvaliteedikontroll eeldab täiendavate indikaatorite kontrollimist, mis iseloomustavad rekombinantse tüve ja plasmiidi stabiilsust, välise geneetilise materjali puudumist preparaadis, ekspresseeritud geeni identsust jne.

1.2 Insuliini preparaadid

Insuliinipreparaadid varieeruvad allika järgi. Siga ja veise insuliin erineb inimese aminohapete koostises: veis kolmest aminohappest ja sea ühest. Ei ole üllatav, et veiste insuliiniga ravimisel tekivad kõrvaltoimed palju sagedamini kui sigade või iniminsuliinidega ravimisel. Neid reaktsioone väljendatakse immunoloogilise insuliiniresistentsuse, insuliini allergia, lipodüstroofia (subkutaanse rasva muutus süstekohal) puhul.

Hoolimata veiste insuliini ilmsetest puudustest on seda maailmas veel laialdaselt kasutatud. Ja veel, immunoloogiliselt on veiste insuliini puudused ilmsed: mingil juhul ei ole soovitatav seda määrata patsientidele, kellel on äsja diagnoositud suhkurtõbi, rasedad naised või lühiajaline insuliiniravi, näiteks perioperatiivsel perioodil. Veiste insuliini negatiivseid omadusi säilitatakse ka juhul, kui neid kasutatakse segus sigadega, mistõttu ei tohiks nende kategooriate patsientide raviks kasutada ka segatud (sigade ja veiste) insuliini.

Iniminsuliini preparaadid keemilise struktuuri jaoks on täielikult identsed iniminsuliiniga.

Iniminsuliini saamiseks vajaliku biosünteetilise meetodi peamine probleem on lõppsaaduse täielik puhastamine kasutatud mikroorganismide ja nende metaboolsete toodete väikseimatest lisanditest. Uued kvaliteedikontrolli meetodid tagavad, et eespool nimetatud tootjate biosünteetiline iniminsuliin ei sisalda kahjulikke lisandeid; seega vastab nende puhastusaste ja glükoosi alandav efektiivsus kõige kõrgematele nõuetele ja on peaaegu samad. Mis tahes soovimatud kõrvaltoimed, sõltuvalt lisanditest, ei sisalda need ravimid insuliini.

Insuliinipreparaadid jaotatakse sõltuvalt toime algusest ja kestusest järgmistesse rühmadesse:
1) kiire ja ultraheli toime insuliinid;
2) lühitoimelised insuliinid (“lihtsad” insuliinid);
3) keskmise kestusega insuliinid (“keskmised” insuliinid);
4) pikatoimelised insuliinid;
5) "segatud" insuliinid - erineva kestusega insuliinide kombinatsioon.

Erinevate nimetustega insuliinipreparaatide arv on mitu tosinat ja mitmed välismaised insuliininimed ning viimastel aastatel lisatakse igal aastal kodumaiseid farmaatsiaettevõtteid.

Kiire ja ultrahelivaba insuliin

Kiire ja ultraheliininsuliin sisaldab praegu kolme uut ravimit - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) ja glulissiin (apidra). Nende eripära on tegevuse kiirem algus ja lõpp, võrreldes tavalise „lihtsa“ iniminsuliiniga. Uute insuliinide glükoosisisaldust alandava toime kiire algus tuleneb nende kiirenenud imendumisest nahaalusest rasvast. Uute insuliinide iseärasused võimaldavad vähendada aega süstide ja toidu tarbimise vahel, vähendada toitumisjärgset glükeemiat ja vähendada hüpoglükeemia esinemissagedust.

Lispro, asparti ja glulissiini toime algus toimub vahemikus 5 kuni 10-15 minutit, maksimaalne toime (toime tipp) on 60 minuti pärast, toime kestus on 3 kuni 5 tundi. Need insuliinid manustatakse 5 kuni 15 minutit enne sööki või vahetult enne seda. On tõestatud, et lisproinsuliini manustamine vahetult pärast sööki tagab ka hea glükeemilise kontrolli. Siiski on oluline meeles pidada, et nende insuliinide manustamine 20 kuni 30 minutit enne sööki võib põhjustada hüpoglükeemiat.

Patsiendid, kes lülituvad nende insuliinide sisseviimisele, peavad sagedamini kontrollima glükeemilist taset, kuni nad õpivad korreleerima tarbitud süsivesikute ja insuliini annuse. Seega määratakse ravimite annused igal üksikjuhul eraldi.

Kui kasutatakse ainult humaloge (insuliin lispro), võib kasutada uut kiiret või algajat (insuliini aspart) või apidra (insuliinglulisiin), neid võib manustada 4-6 korda päevas ja kombinatsioonis pikaajalise toimega insuliinidega 3 korda päevas. Erandjuhtudel on lubatud ühekordne annus 40 U. Neid insuliini, mis on saadaval viaalides, võib segada samas süstlas pikema toimeajaga iniminsuliinipreparaatidega. Kui see kiire insuliin kogutakse esmalt süstlasse. Süstimine on soovitav teha kohe pärast segamist. Need kolbampullides toodetud insuliinid (spetsiaalsed varrukad) ei ole ette nähtud segude valmistamiseks teiste insuliinidega.

See on oluline!
Aktiivse elustiiliga patsientidele on mugav kasutada uusi kiireid insuliini, nende kasutamine on soovitatav ägedate infektsioonide, emotsionaalse stressi, toiduainete süsivesikute hulga suurendamise, hüperglükeemiat soodustavate ravimite (kilpnäärme hormoonid, kortikosteroidid - prednisoloon jne) kasutamisel koos teiste talumatustega insuliinipreparaadid või toitumisjärgne hüperglükeemia, mis on teiste insuliinide toime suhtes halvasti rahuldav. Veelkord tuleb rõhutada, et kiiretoimelised insuliinid tuleb kasutada otseselt toidu tarbimise korral.