Glükoosi määramine glükoosi oksüdaasi meetodil

  • Analüüsid

Glükoosi kontsentratsiooni määramine veres on üks kõige sagedamini teostatud biokeemilisi uuringuid laborites.

Glükoosi oksüdaasi meetod veres ja uriinis glükoosi määramiseks põhineb glükoosi oksüdatsiooni reaktsioonil glükoosi oksüdaasi ensüümi juuresolekul vesinikperoksiidi moodustumisega, mis omakorda peroksidaasi juuresolekul oksüdeerib orthotolidiini värviliste toodete moodustamiseks; o Glükoosi kontsentratsiooni lubab värviliste toodete kogus.

Kuna glükoosi oksüdaasi meetod on suunatud glükoosi ja mitte kõigi suhkruliikide identifitseerimisele, kasutatakse seda järgmiste haiguste diferentsiaaldiagnostikas:

Glükoosi oksüdaasi meetodi põhimõte glükoosi määramiseks

Glükoos ensüümi glükoosi oksüdaasi juuresolekul oksüdeerub atmosfääri hapnikuga, moodustades reaktsiooni käigus vesinikperoksiidi. Vesinikperoksiid peroksidaasensüümi juuresolekul oksüdeerib ortotolutidiini, moodustades värvilise ühendi, mille värvi intensiivsus on proportsionaalne glükoosisisaldusega. See meetod võimaldab määrata glükoosi taset vereplasmas, seerumis ja tserebrospinaalvedelikus.

Normaalne vere glükoosisisaldus, mmol / l

- plasmas, natsheartse'is

  • vastsündinud - 1,7 - 4,2
  • 6-nädalased kuni 15-aastased lapsed - 3,3–5,4
  • täiskasvanud (mehed, naised) - 3,9 - 5,6

- seerumis, natsheartse

  • vastsündinud - 2.6 - 4.2
  • lapsed alates 6 nädalast kuni 2 aastani - 3,3 - 5,4
  • täiskasvanud (mehed, naised) - 3,9 - 5,6

Vajalikud reaktiivid glükoosi määramiseks glükoosi oksüdaasi meetodil

1. Naatriumkloriid 9 grammi liitri kohta (isotooniline lahus): valmistatud 0,9 g NaCl lahustamisega 100 ml vees.

2. Tsinksulfaat, 50 g / l: 5 g tsinksulfaati (ZnSO4) lahustatakse vees, ruumala viiakse 100 ml-ni.

3. Naatriumhüdroksiid, 0,3 mol / l: valmistatud, lahustades 1,2 g NaOH 100 ml vees, kontsentratsiooni kontrollitakse tiitrimisega (see peaks olema 0,3 n).

4. Orthotolidiin, 1% lahus: 1 g ravimit lahustatakse 100 ml absoluutses alkoholis. Lahust võib hoida külmkapis klaasist korgiga kolvis mitu kuud. Kaubanduslikult saadavat produkti saab puhastada ümberkristallimise teel, mille jaoks see lahustatakse absoluutses alkoholis, lisatakse vett ja sadestunud kristallid imetakse filtril välja, seejärel kuivatatakse kaltsiumkloriidi kohal.

5. Atsetaatpuhverlahus pH 4,8: ​​segatakse 4 osa 0,25 n äädikhapet (kontrollitakse tiitrimise teel) ja 6 osa 0,25 n naatriumatsetaati (sisaldab 34 g CH3COONa X ЗН2О 1 liitris).

6. Glükoosi oksüdaas on kuivpreparaat, mille aktiivsus on 3000 ühikut / mg või rohkem.

7. Mädarõika peroksidaas. 1 mg lahustatakse 5 ml atsetaatpuhvris, seda võib hoida külmkapis mitu päeva.

8. Tööreagens: 2 mg glükoosi oksüdaasi ja 1 mg peroksidaasi lahustatakse 80 ml atsetaatpuhvris, lisatakse 1 ml 1% ortotolueeniini lahust, segatakse ja viiakse lahus 100 ml-ni puhverlahusega. Tööreagens peab olema läbipaistev, värvitu või nõrga rohelise tooniga, millisel juhul see on külmades säilitades stabiilne. Kui värv on intensiivne või mõne tunni pärast pärast valmistamist hakkab sade langema, tähendab see, et ortotoluidiin ei ole piisavalt puhas ja vajab ümberkristallimist.

9. Glükoosilahuste kalibreerimine. Glükoosi kuivatatakse temperatuuril 37 ° C ja säilitatakse eksikaatoris. Esmalt valmistage aluslahus kontsentratsiooniga 50 mmol / l, mille jaoks lahustatakse 180 mg bensoehappe küllastunud lahuses (ligikaudu 0,3%). Sellest lahusest valmistatakse 3-kordselt töötavad kalibreerimislahused; 6; 9; 12; 15; 18 ja 21 mmol / l, mille puhul nad võtavad 0,6; 1.2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 ja 4,2 ml aluselist lahust ning viiakse bensoehappe küllastunud lahus mahuni 10 ml. Need lahused sisaldavad glükoosi samades kontsentratsioonides nagu veres, mis hõlbustab kalkuleerimist kalibreerimise ajal.

Glükoosi määramine glükoosi oksüdaasi meetodil

Tsentrifuugikatsutites segatakse 1,1 ml naatriumkloriidi lahust, 0,4 ml tsingisulfaadi lahust ja 0,4 ml 0,3 n NaOH lahust; samal ajal moodustub väga õhuke tsinkhüdroksiidi geel, 0,1 ml verd või kalibreerimislahust vabastatakse, segatakse uuesti ja tsentrifuugitakse 10 minuti pärast kiirusel 3000 p / min 10 minutit.

1 ml supernatandile lisatakse 3 ml tööreagenti ja segage õrnalt.

Värv hakkab järk-järgult arenema, mis normaalse toatemperatuuril jõuab maksimaalselt 13-15 minuti jooksul ja seejärel järk-järgult väheneb. Fotomeetriliselt alati pärast sama ajavahemikku pärast tööreagendi lisamist küvettidesse, mille optilise tee pikkus on 1 sentimeeter punase valgusfiltriga (lainepikkus 625 nm) tühikäigu kogemuse vastu, mis määratakse samaaegselt töötavate proovidega, kuid veri asemel võetakse füsioloogiline naatriumkloriidi lahus.

Kalibreerimisgraafiku ettevalmistamisel võetakse vereproovide asemel 0,1 ml sobivat kalibreerimislahust.

Glükoosi arvutamine võib toimuda vastavalt proportsioonireeglitele või kalibreerimisgraafikule, et ehitada glükoosi kontsentratsioon (mmol / l) ühele teljele ja ekstinktsiooniväärtus teisel.

Märkused glükoosi määramise meetodi kohta glükoosi oksüdaasi meetodil

1. Esmalt võib verd pipetist vabastada naatriumkloriidi isotoonilisse lahusesse ja seejärel lisada tsinksulfaadi ja NaOH lahused.

2. Süstemaatilise töö korral ei ole vaja pidevalt kalibreerimiskava koostada kõigi punktide jaoks, piisab tühja proovi töötlemisest ja 2-3 punktist vahemikus 3–9 mmol / l päevas ning ehitada täielik kalibreerimisgraafik ainult reaktiivide vahetamisel või protseduuri kohandamisel.

Glükoosi oksüdaasi meetod glükoosi määramiseks

Glükoosi oksüdaasi meetodit kasutatakse glükoosi kontsentratsiooni määramiseks ainult erinevates kehavedelikes. Selle testi eeliseks on selle täpsus. Diagnostika, erinevalt kiiretest meetoditest, võimaldab avaldada puhta glükoosi kogust ilma fruktoosi ja muude suhkruteta. Selle reaktsiooni põhimõte on lahuse värvimine, mis tekib oksüdeerivate ainete koostoime tulemusena spetsiifiliste värvainetega. Uurimistulemuste hindamine toimub kolorimeetria meetodil ja võrdlus standardlahustega.

Millal on määratud glükoosi oksüdaasi meetod?

Seda testi kasutatakse suhkru taluvuse ja pre-diabeedi, samuti haiguse kõrguse tuvastamiseks. Kuid sellistel eesmärkidel kasutatakse analüüsi harva, see on tingitud selle kõrgetest kuludest ja pika tulemuse ootamisest. Kõige sagedamini kasutatakse seda meetodit kasutades glükoosi määramist veres ja uriinis selliste haiguste diferentsiaaldiagnoosimisel nagu:

  • laktoosi talumatuse sündroom;
  • fruktoosi talumatus;
  • fruktoosi vabanemine kehavedelikega;
  • suurenenud pentoosi kontsentratsioon uriinis.

Glükoosi oksüdaasi testi kahtlemata eelis on selle täpsus.

Mis on selle meetodi aluseks?

Glükoosi kontsentratsiooni määramiseks veres on erinevaid meetodeid, kuid kõige täpsem on glükoosi oksüdaas. Alumine rida on see, et suhkru ja hapniku interaktsioon õhus oksüdeerib reaktiivi. Lahusesse lastakse vesinikperoksiidi. See aine interakteerub ortotolueeniiniga, moodustades värvilise ühendi. Selle reaktsiooni käitumiseks on vaja spetsiaalseid ensüüme. Oksüdatsioonireaktsioonis peab olema glükoosi oksüdaas ja vedeliku värvimisel peroksidaas. Lahuse värvi intensiivsus sõltub glükoosi sisaldusest ja on kõrgeima sisaldusega kõige intensiivsem.

Glükoosi oksüdaasi meetodi olemus glükoosi määramiseks

Tulemuse hindamine toimub fotomeetria kvantitatiivse meetodi abil samal ajavahemikul. Kasutage kindlasti kalibreerimislahust, mis sisaldab teatavat teatavat suhkru määra ja alates sellest saab hinnata glükoosi kontsentratsiooni kehavedelikes, sageli veres.

Kuidas analüüsi tehakse?

Materjal võetakse patsiendilt tühja kõhuga. Katse jaoks, milles kasutatakse venoosset verd koguses 5 ml. Diagnoosi eelõhtul näidatakse patsiendile ranget dieeti. See võimaldab hinnata tulemuse usaldusväärsust ja välistada võimalikud analüüsivead. 2 päeva enne vere võtmist peab patsient loobuma alkoholi ja suitsetamise halbadest harjumustest. Samuti on vaja piirata liiga magusate toitude tarbimist ja võimaluse korral vältida stressirohkeid olukordi.

Kõige sagedamini teostatakse see glükoosi kontsentratsiooni määramise meetod tsentrifuugimise meetodil, mida kasutatakse vormitud elementide eraldamiseks. Suhkru kogus määratakse plasmas. Kui sellele lisatakse kõik vajalikud reagendid, jälgitakse 20 minuti pärast värvi, kui katse viiakse läbi toatemperatuuril. Glükoosi taseme arvutamine toimub vastavalt kalibreerimisgraafikule või portsjonite reeglitele.

Uurimisreagendid

Suhkru määramiseks on kõige mugavam kasutada vere glükoosi määramiseks kiirmeetodeid. See on tingitud kasutusmugavusest ja kiiretest tulemustest. Lisaks ei pea patsient laborisse või haiglasse minema. Kuid erinevalt glükoosi oksüdaasi testist on selline diagnoos ebausaldusväärne. Kuna see ei erista glükoosi teistest suhkrutest ja määrab nende kontsentratsiooni koos.

Glükoosi oksüdaasi reaktsiooni aluseks on 9% naatriumkloriidi lahus ja 50% tsingisulfaat. Need lisatakse vere tsentrifuugimise etapis. Lisaks kasutatakse puhverlahust, mis sisaldab äädikhapet ja naatriumatsetaati. Tiitrimismeetod määrab selle pH väärtuse 4,8. Seejärel lisatakse glükoosi oksüdaas, mis põhjustab vesinikperoksiidi ja peroksidaasi, mis on seotud lahuse värvimisega soovitud kontsentratsioonini, et saada täpne tulemus.

Standardid analüüsi ajal

Suhkru kogust mõõdetakse spetsiaalsetes ühikutes - millimeetrit lahuse liitri kohta.

Glükoosi oksüdaasi vereanalüüsid tuleb teha tühja kõhuga ning selleks kasutatakse plasmat või seerumit. Nii naiste kui ka meeste täiskasvanute arv on 3,3-5,5. Alla 15-aastaste laste puhul on see näitaja veidi väiksem ja varieerub vahemikus 3,2–5,3. Vastsündinutel on vere glükoosisisaldus 1,7–4,2. Toimivuse suurenemist täheldatakse suhkurtõvega patsiendi või glükoositaluvuse rikkumise korral. See seisund on prediabeet ja kui seda ei ravita õigeaegselt, siis varsti see viib selle raske patoloogia tekkeni.

TÖÖ number 1. GLÜKOSI KVANTITATIIVNE MÄÄRAMINE VERAS. ENZÜMEETiline (glükoosooksidaalne) meetod

TÖÖ TÄITMISE PÕHJENDUS. Glükoosi määramine täisveres või plasmas viiakse läbi igas patsiendis, et hinnata süsivesikute metabolismi seisundit ja diagnoosida patoloogiat (hüperglükeemia, hüpoglükeemia). Vere glükoosisisalduse määramiseks kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb glükoosi oksüdeerimisel glükoosi oksüdaasiks hapniku juuresolekul. Meetod on väga spetsiifiline D-glükoosi määramiseks teiste redutseerivate ainete juuresolekul koekstraktides ja bioloogilistes vedelikes.

MEETODI PÕHIMÕTE. Glükoosi oksüdaas on kompleksne ensüüm, mis sisaldab proteeside rühma FAD. Kui glükoosi oksüdeerib glükoosi oksüdaas, eralduvad kaks vesinikuaatomit glükoosimolekuli esimesest süsinikuaatomist. Lisaks kantakse need kaks vesinikuaatomit FAD-sse, moodustub FADH2. Viimane kannab vesinikuaatomid molekulaarsesse hapnikku, et moodustada H2Oh2. Siis H2Oh2 see lõhustub peroksidaasensüümiga vette ja aatomi hapnikku, mis oksüdeerimise ajal värvunud kromogeeni (värvi) oksüdeerib.

Glükoosi oksüdaasi meetod

Tänapäeval kasutatakse kõige enam ensüümi glükoosi oksüdaasi kasutamisel põhinevaid meetodeid. Meetod põhineb järgmisel reaktsioonil:

Glükoosi oksüdaas katalüüsib kahe vesiniku aatomi ülekandmist glükoosi esimesest süsinikuaatomist vedelas reagendis lahustunud hapnikule. Reaktsiooni käigus moodustub vesinikperoksiid ekvimolaarsetes kogustes. St moodustunud vesinikperoksiidi kontsentratsioon on võrdne glükoosi määratud kontsentratsiooniga. Järelikult muutis glükoosi oksüdaasi reaktsiooni kasutamine glükoosi kontsentratsiooni määramise probleemi vesinikperoksiidi kontsentratsiooni määramise probleemiks, mis, nagu allpool näidatud, on palju lihtsam kui esimene. Ja siin on mitmeid meetodeid, mida tänapäeval laialdaselt kasutatakse laboripraktikas (vt joonist).

Ülaltoodud registreerimismeetodite hulgas on kõige laialdasemalt kasutatav fotomeetriline biokeemiline meetod, milles peroksidaasi ensüümi toimel moodustavad vesinikperoksiidimolekulid aktiivse hapniku vormi moodustamiseks - superoksiidi anioonradikaal - O2 -, mis omakorda oksüdeerib kroomi, mis toob kaasa olulise muutuse kromogeeni absorptsioonispektris.

Selle meetodi kõrge populaarsus glükoosi määramiseks on tingitud selle kõrgest spetsiifilisusest ja lihtsusest. Meetodit saab rakendada tavapärase fotomeetri abil, samuti kasutades automaatset biokeemilist autoanalüsaatorit.

Glükoosi oksüdaasi meetodit tuntakse tänapäeval glükoosi määramise üheks kõige täpsemaks kvantitatiivseks meetodiks. Bioloogilise materjalina kasutatakse seerumit ja täisverd. Viimasega töötamisel tuleb arvestada asjaolu, et kapillaarveri võtmisel sõltub seerumi (plasma) osakaal hematokriti väärtusest, mis võib negatiivselt mõjutada tulemuse täpsust. Seetõttu on ülalkirjeldatud meetodil glükoosi määramisel soovitatav kasutada patsiendi seerumit.

Koos lõpp-punkti fotomeetrilise meetodiga ilmusid mitu aastat tagasi komplektid, milles rakendati kineetilist fotomeetrilist meetodit. Meetodi olemus seisneb selles, et glükoosi oksüdaasi ja peroksidaasi aktiivsuse teatud suhtel on värvilise ühendi moodustumise kiirus mõnda aega pärast proovi lisamist töölahusele proportsionaalne proovi glükoosi kontsentratsiooniga. Selle meetodi eeliseks on see, et tulemus ei sõltu teiste ühendite olemasolust proovis, kuna viimase imendumine on aja jooksul stabiilne. See meetod nõuab kineetilist fotomeetrit, poolautomaatset analüsaatorit või automaatset biokeemilist analüsaatorit. Glükoosi kontsentratsiooni mõõtmine täisverest teostatakse mugavalt instrumentide abil, mille töö põhineb amperomeetrilisel mõõtmise põhimõttel, kasutades spetsiaalseid ensüümsensoreid. Vesinikperoksiid on äärmiselt ebastabiilne keemiline ühend ja see võib olla laetud osakeste allikaks. Seda kasutatakse membraanitüübi või kantavate glükomeetrite elektrokeemiliste elementide ensüümsensorites.

Kokkuvõttes peaksime mainima glükoosi oksüdaasi meetodi puudusi. Saadud vesinikperoksiidi ja superoksiidi anioonradikaal võib oksüdeerida mitte ainult kroomi, vaid ka teisi bioloogilises vedelikus olevaid aineid: askorbiinhapet, kusihapet, bilirubiini. Samal ajal väheneb vastavalt kromogeeni oksüdeerimises osaleva peroksiidi osakaal, mis viib glükoosi tulemuse alahindamiseni. See meetod on reeglina lineaarne kuni 20-30 mmol / l glükoosi.

Vere glükoosisisalduse kvantitatiivne määramine glükoosi oksüdaasi meetodil

Meetodi põhimõte. Meetod põhineb glükoosi oksüdaasi ensüümi toime spetsiifilisusel. See ensüüm oksüdeerib glükoosi molekulaarse hapniku juuresolekul, moodustades glükonolaktooni, mis hüdrolüüsub spontaanselt glükoonhappeks. Glükoosi oksüdaas oksüdeerib glükoosi vesinikperoksiidiks (H2Oh2), mis peroksidaasi toimel reageerib 4-aminoantipüriini ja fenooliga. Tulemuseks on roosa värviline ühend, mille optiline tihedus 510 nm juures on proportsionaalne proovis sisalduva glükoosi kontsentratsiooniga.

2 N2Oh2 + 4-aminoantipüriin + fenool → kinoonimiin + 4H2Oh

Varustus: KFK, tsentrifuug, termostaat, statiivid, katseklaasid, pipetid, bioloogiline materjal, töölahuses sisalduvad reaktiivid.

proov, ml

standardproov, ml

ühekordne katse (N2O), ml

Glükoosilahuse kalibreerimine (standard)

Torusid inkubeeritakse termostaadis 37 ° C juures 15 minutit, seejärel kolorimeeritakse rohelise filtriga rohelisel filtril küvettides, mille kihi paksus on 5 mm tühjaga (H2O). Roosa värv on stabiilne 1 tund pärast inkubeerimist.

Arvutamine glükoosisisaldus, mis on toodetud järgmise valemi abil:

C = x C standard, kus

C on katseproovi glükoosi sisaldus, mol / l;

Eop on proovi optiline tihedus;

Est on kalibreerimisproovi optiline tihedus;

С standard - sisaldus kalibreerimislahuses, mol / l.

Normaalväärtused:  vastsündinud - 2,8-4,4 mmol / l

 lapsed - 3,9 -5,8 mmol / l

 täiskasvanud - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hüpoglükeemia (HGH). Vere glükoosisisalduse suurenemine on tingitud paljudest põhjustest, mille kohaselt on olemas kaks hüperglükeemia rühma.

1. Insular - seotud ebapiisava sisaldusega insuliini kehas või selle toime ebatõhususe tõttu.

2. Extrainsular (extrainsular) - ei sõltu insuliini toimest.

HGH moodustumisel on kõige olulisemad järgmised protsessid: suurenenud glükogeeni lagunemine; suurenenud neoglükogenees; glükogeeni sünteesi pärssimine; glükoosi ärakasutamise vähenemine kudede all hormonaalsete insuliinantagonistide mõjul: somatotropiin, glükortikoidid, türoksiin, türeotropiin.

Tugevat glükoosisisaldust veres täheldatakse hüperglükeemiaga (näiteks hüperglükeemia suhkru koormuse all). Maksa hüperglükeemia tekib difusiooni maksakahjustustes.

Püsiv ja raske hüperglükeemia on kõige sagedamini kaasas diabeediga. Tavaline on isoleerida insuliinsõltuv suhkurtõbi ja insuliinisõltumatu suhkurtõbi või vastavalt I tüüpi suhkurtõbi ja II tüüpi suhkurtõbi. I tüüpi suhkurtõve teke on seotud peamiselt insuliini sünteesi ja vahetamisega.

Teine hüperglükeemia rühm on seotud peamiselt hormonaalseid hormoonide - insuliini antagonistide - hüperfunktsiooniga. Seda täheldatakse sellistes haigustes nagu sündroom ja Cushingi tõbi, akromegaalia, türeotoksikoos, feokromotsütoom, glükogenoom. Vere glükoosisisaldus suureneb ka teatud maksahaiguste korral (eriti 10–30% maksatsirroosiga patsientidest), hemokromatoos (maksa pigmenteeritud tsirroos, pronksdiabeet).

Hüpoglükeemia (HGP) - vere glükoosisisalduse vähenemine - kõige sagedamini seostub absoluutse või suhtelise insuliinitaseme tõusuga veres. Vnepankreaticheskim hüpoglükeemia täheldatud tulemusena tasakaalus ulatuses protsesse glükogenolüüs ja glükoneogeneesi maksas ajal äge ja krooniline hepatiit, maksatsirroos, äge ja alaäge maksahaigus, alkoholimürgistuse, mürgistus arseen, fosfor, pikaajalisel mehaanilise kollatõbe, kongestiivse maksa, primaarne või metastaseerunud maksavähk. Patsientidel, kes põevad söögitoru vähki ja teisi ekstrapankreaalse lokaliseerumise pahaloomulisi kasvajaid (fibroom, fibrosarkoom, neuroom), samuti indomutoorse oksendamise, anoreksia, maksa diabeedi, uremia, rikkaliku laktatsiooni ja glükoosuuriaga rasedatel naistel, on sageli täheldatud vere glükoosi kontsentratsiooni vähenemist.

Hüpoglükeemia võib olla keskse päritoluga vaimse trauma, entsefaliidi, subarahnoidaalse verejooksu, ajukasvaja tõttu.

1. Süsivesikute seedimise pärilikud häired.

2. Millist tüüpi hüperglükoos on teile teada?

3. Millised on patoloogilise hüperglükoosi põhjused?

4. Mis on insuliinsõltuva suhkurtõve põhjus?

5. Millised on pärilike haiguste biokeemilised põhjused: a) glükogenoos? b) aglükogenoos? c) fruktoemia? d) galaktosemia?

6. Millised on biokeemilised muutused süsivesikute ainevahetuses tühja kõhuga?

7. Glükoositaluvuse määramise meetodi põhimõte.

Glükoosi oksüdaasi ja heksokinaasi meetodid seerumi glükoosisisalduse määramiseks veres

Täpne diagnoosimine, ravi väljakirjutamine nõuab mitmeid laboratoorsed testid.

Seerumi glükoosi määramise meetod on diabeediga patsientidel hüper- ja hüpoglükeemia avastamise kõige olulisem vahend.

Meetod võimaldab kohandada meditsiinilise ravi metaboolseid häireid. Diagnostilisi glükoositasemeid saab määrata ka täisveres ja selle plasmas.

Vere glükoosisisalduse määramise meetodid

Vere glükoosi koguse määramise meetodid muutusid palju.

Mõned neist (redigeeromeetriline, kolorimeetriline) ei ole praktiliselt kasutatavad kõrge toksilisuse ja tulemuste madala täpsuse tõttu.

Kõige sagedamini kasutatavad ensüümi uuringud. Glükoosi oksüdaasi meetod on värvireaktsiooni meetod, mis tekib siis, kui süsivesikuid kuumutatakse. Heksokinaas määrab vere aktiivsuse heksokinaasil.

Glükoosi oksüdaasi meetod

Glükoosi oksüdaasi meetod vere glükoosi määramiseks põhineb selle oksüdatsioonireaktsioonil ensüümi mõjul. See moodustab vesinikperoksiidi, värvib kromogeeni, mille kontsentratsioon määrab glükoosi koguse.

Glükoosi oksüdaasi meetodit kasutatakse:

  • pärilik fruktoosi talumatus;
  • pentozurii;
  • laktoositalumatus.

Uuringu puuduseks on see, et vesinikperoksiid on võimeline oksüdeerima nii kroomi kui ka askorbiini, kusihapet ja veres sisalduvat bilirubiini. Arvutage glükoosi fotomeetrilise meetodi kogus, värvimise intensiivsust võrreldakse kalibreerimisgraafikuga.

Laboritingimustes võib aine taseme kindlaks määrata:

  1. venoosse verega. Kasutatakse automaatset analüsaatorit;
  2. kapillaarveres. Aed tehakse sõrmelt.

Elektrokeemiline meetod seisneb glükoosi oksüdaasi sisaldavate elektroodide kasutamises. Määratakse tekkinud vesinikperoksiidi kogus või oksüdatsiooniprotsessi käigus tarbitud hapniku ülejäänud tase.

Hexokinaasi meetod

Aine on glükoosi ainevahetuse kõige olulisem ensüüm, mis piirab rakkude kiirust.

Laboratoorsetes tingimustes fosforüülitakse glükoos heksokinaasi toimel adenosiintrifosfaadiga.

Reaktsiooni tulemusena moodustuvad orgaanilised molekulid, mille koguse määrab valguse neeldumise tase ultraviolettvööndis. Liiga kiire positiivne heksokinaasi reaktsioon võib olla ka märk pahaloomuliste kasvajate esinemisest.

Analüüsi ettevalmistamine

Vere seerumi glükoositestid on ette nähtud:

Enne analüüsimist peate järgima mitmeid tingimusi, et tulemused oleksid võimalikult usaldusväärsed:

  1. uuringud viiakse läbi tühja kõhuga. Hommikul võetud materjal;
  2. paar päeva enne diagnoosi on vaja vältida rasket füüsilist pingutust, stressi;
  3. Igapäevases toitumises peab patsient olema vähemalt 150 grammi süsivesikuid. Puuduse korral suureneb glükoosi tase ja see langeb aeglaselt, mis moonutab andmete analüüsi;
  4. päeval enne diagnoosi ei saa suitsetada ja juua alkohoolseid jooke;
  5. pärast raskete operatsioonide, sünnituse ja põletike juuresolekul ei ole võimalik teha uuringuid. Vastunäidustatud maksatsirroosi analüüsil, mao haiguste ägenemisel, kasvaja protsessidel;
  6. paar päeva enne uuringut ei tohiks teha füsioterapeutilisi protseduure, võtta suukaudseid rasestumisvastaseid vahendeid, diureetikume, psühhotroopseid ravimeid, kofeiini.

Analüüs võib anda valepositiivse tulemuse hüpokaleemia ja endokriinsete haiguste korral (Cushingi sündroom, türeotoksikoos).

Glükoosi normid vereseerumis vanuse järgi

Tavalised näitajad sõltuvad vanusest:

  • nabaväädi veres võib olla 2,5 kuni 5,3 mmol / l;
  • enneaegsetel imikutel - 1,1 kuni 3 mmol / l;
  • esimese elupäeva lapsed - 2,22-3,33;
  • vanuses 2,7 kuni 4,4;
  • üle 6-aastastel lastel - 3,3-5,5 mmol / l;
  • täiskasvanutel kuni 60 aastat - 4,4 kuni 6,3;
  • eakatel - 4,6 kuni 6,1 mmol / l.

Hüpoglükeemia diagnoosimisel täiskasvanutel on glükoosi väärtused alla 3,3 mmol / l ja hüperglükeemia - rohkem kui 6,1 mmol / l.

Glükoosi oksüdaasi meetod glükoosi määramiseks plasmas

Meil on hea meel teid tervitada veebilehel www.unimedao.ru!

Tänan teid meie küsimusele vastamise eest.

11/19/2009

Gerasimenko V.A, Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.


Ajalehe "News A / O Unimed" arhiivist

Glükoosi kontsentratsiooni määramine veres on üks kõige sagedamini teostatud biokeemilisi uuringuid QDL-is. Katse erakordse populaarsuse põhjus on seotud diabeedi suure esinemissagedusega. See katse viiakse läbi nii statsionaarsetes kui ka ambulatoorsetes kliinikus. Diabeediga patsiendid on sunnitud uurima vere glükoosisisaldust kodus, sest ilma selle informatsioonita on neil raske kohandada oma dieeti, treeningut, insuliini ja teiste diabeediravimite kasutamist. Katse erakordne tähtsus ja suured uuringute mahud on stimuleerinud arendajaid looma erinevat tüüpi seadmeid ja meetodeid glükoosi kontsentratsiooni määramiseks veres.

Praegu on glükoosi määramiseks palju meetodeid. Neid võib liigitada järgmiselt.

Meetodid glükoosi määramiseks seerumis

- fotomeetriline tulemusnäitaja

- peegeldav fotomeetria - kuiv keemia

Kaks esimest meetodit on äärmiselt ebamugavad, mürgised ja nende täpsus on madal, nii et me neid ei ela.

Glükoosi oksüdaasi meetod

Tänapäeval kasutatakse kõige enam ensüümi glükoosi oksüdaasi kasutamisel põhinevaid meetodeid. Meetod põhineb järgmisel reaktsioonil:

Glükoosi oksüdaas katalüüsib kahe vesiniku aatomi ülekandmist glükoosi esimesest süsinikuaatomist vedelas reagendis lahustunud hapnikule. Reaktsiooni käigus moodustub vesinikperoksiid ekvimolaarsetes kogustes. St moodustunud vesinikperoksiidi kontsentratsioon on võrdne glükoosi määratud kontsentratsiooniga. Järelikult muutis glükoosi oksüdaasi reaktsiooni kasutamine glükoosi kontsentratsiooni määramise probleemi vesinikperoksiidi kontsentratsiooni määramise probleemiks, mis, nagu allpool näidatud, on palju lihtsam kui esimene. Ja siin on mitmeid meetodeid, mida tänapäeval laialdaselt kasutatakse laboripraktikas (vt joonist).

Ülaltoodud registreerimismeetodite hulgas on kõige laialdasemalt kasutatav fotomeetriline biokeemiline meetod, milles peroksidaasi ensüümi toimel moodustavad vesinikperoksiidimolekulid aktiivse hapniku vormi moodustamiseks - superoksiidi anioonradikaal - O2 -, mis omakorda oksüdeerib kroomi, mis toob kaasa olulise muutuse kromogeeni absorptsioonispektris.

Joonisel fig. Joonised fig 1 ja 2 näitavad töölahuse spektreid enne ja pärast standardse glükoosilahuse lisamist. Reaktsioonisegu maksimaalne absorptsioon (reaktiiv + glükoos) on vahemikus 500 nm. Järelikult on lõppreaktsiooni optilise tiheduse muutus lainepikkusel 480-520 nm proportsionaalne proovis sisalduva glükoosi kontsentratsiooniga.

Selle meetodi kõrge populaarsus glükoosi määramiseks on tingitud selle kõrgest spetsiifilisusest ja lihtsusest. Meetodit saab rakendada tavapärase fotomeetri abil (parem kui spetsiaalne biokeemiline fotomeeter nagu Mikrolab 540) või automaatse biokeemilise autoanalüsaatori abil.

Koos lõpp-punkti fotomeetrilise meetodiga ilmusid mitu aastat tagasi komplektid, milles rakendati kineetilist fotomeetrilist meetodit. Meetodi olemus seisneb selles, et glükoosi oksüdaasi ja peroksidaasi aktiivsuse teatud suhtel on värvilise ühendi moodustumise kiirus mõnda aega pärast proovi lisamist töölahusele proportsionaalne proovi glükoosi kontsentratsiooniga. Selle meetodi eeliseks on see, et tulemus ei sõltu teiste ühendite olemasolust proovis, kuna viimase imendumine on aja jooksul stabiilne. See meetod nõuab kineetilist fotomeetrit, näiteks Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, poolautomaatseid analüsaatoreid, nagu Clima 15, või automaatset biokeemilist analüsaatorit. Glükoosi kontsentratsiooni mõõtmine täisverest teostatakse mugavalt instrumentide abil, mille töö põhineb amperomeetrilisel mõõtmise põhimõttel, kasutades spetsiaalseid ensüümsensoreid. Vesinikperoksiid on äärmiselt ebastabiilne keemiline ühend ja see võib olla laetud osakeste allikaks. Seda kasutatakse membraanitüübi või kantavate glükomeetrite elektrokeemiliste elementide ensüümsensorites.

Kogu vereproovi (tavaliselt 20 ui) lahjendatakse süsteemi puhverlahuses (punased verelibled hävitatakse) ja seejärel toidetakse vooluahelasse läbi joone. Glükoos oksüdeerub membraanil oleva ensüümi glükoosi oksüdaasi mõjul. Saadud vesinikperoksiid difundeerub läbi membraani ja oksüdeeritakse edasi plaatina toimel katalüütilises reaktsioonis. Vesinikperoksiidi difusioon plaatina pinnal moodustab molekulide H arvuga proportsionaalse voolu2Oh2. Selliselt saadud signaal töötleb seade vastava pinge väärtusega. See mõõdetud väärtus on proportsionaalne proovis sisalduva glükoosi kontsentratsiooniga.

Näitena eespool kirjeldatud meetoditest võib mainida Bioseni glükoosi analüsaatoreid (Saksamaa). Need seadmed on mugavad kasutamiseks mitte ainult haiglates, vaid ka polükliinikates, kus glükoosi testimine toimub peamiselt kapillaarverest.

Oluline samm kliiniliste laboratoorsete diagnostikameetodite väljatöötamisel oli "kuiva keemia" tekkimine. Loomulikult oli selle tehnoloogia üks esimesi rakendusi glükoosi määramine patsiendi veres. Esimesed seadmed olid tavapäraste laboratoorsete uurimismeetodite puhul täpselt halvemad. Aja jooksul aga suutis mitu ettevõtet välja töötada sellised diagnostilised ribad ja peegeldavad fotomeetrid, mis andsid analüüsi väga suure täpsuse. One Touch glükomeetrid ja Life Scan (USA) testribad on kogu maailmas laialdaselt populaarsed, ühendades edukalt kvantitatiivse ensümaatilise meetodi analüütilise täpsuse "kuiva keemia" kiiruse ja lihtsusega.

Ühe puudega vere glükoosimõõturid on mõeldud glükoositaseme kiireks ja täpseks mõõtmiseks täisveres. One Touch testriba sisaldab kõiki vajalikke keemilisi komponente kaheastmelise glükoosi oksüdaasi meetodi jaoks, kaasa arvatud glükoosi oksüdaasi ja peroksidaasi ensüümid, mis adsorbeeritakse ainulaadsele poorsele hüdrofiilsele membraanile. Reaktsiooni tulemus on värvilise kompleksi moodustumine. Arenenud värvi intensiivsus registreeritakse peegeldava miniphotomeetriga.

Membraani testriba One Touch meenutab mikroskoopiliste pooridega käsna ja täidab kolmekordset funktsiooni. See toimib: 1) reservuaarina, kogudes vajaliku koguse verd, 2) filtrina, blokeerides tahke rakulise materjali (erütrotsüüdid, leukotsüüdid jne), 3) sileda optilise pinnana, millel mõõdetakse peegeldunud valgust. Viimane funktsioon on eriti oluline seadme tööks. See võimaldab lugeda riba alumist osa, samal ajal kui veri jääb testriba ülemisele osale. Seega ei ole vaja pesta (blotida) testriba pinnalt.

Lisaks on membraanil hüdrofiilseid omadusi, mille tõttu tõmbub katseriba pinnale tilk verd, kui see puudutab.

One Touch seadmes on kaks spetsiaalset LED-i. Arenenud värvi töötlemine testribal on järgmine. Niipea, kui testriba on seadmesse sisestatud, toimub nullilugemine. Sel hetkel näeme ekraanil: “Oota”. Kui katseriba kantakse veri tilk, sorbeeritakse vereplasma koheselt membraaniga, samas kui erütrotsüüdid ja ülejääk plasmas jäävad membraani pinnale. Pärast verepilari täielikku imendumist tekib kohe värvimine. Seade salvestab peegelduse suuruse muutuse ja käivitab taimer automaatselt. 45 sekundi pärast lõpeb keemiline reaktsioon, valguspeegelduse tulemus töödeldakse. Värviline reaktsioonisaadus neelab esimese LED-i kiirguse. Vererakud ja ülejääk plasmas neelavad ka dioodi kiirgava valguse. Taustpeegelduse korrigeerimiseks teostab teine ​​lugemine teise LED-i abil erineval lainepikkusel. Esimese ja teise LED-i signaalide vahe annab teavet valguse imendumise kohta kroomi poolt. Kromogeenist saadud glükoosi kontsentratsiooni hindamiseks saadud signaal korreleerub spetsiaalse kalibreerimisega. Kõik One Touch-seadmed kalibreeritakse laboratoorsete glükoosi analüsaatorite võrdlusmeetodi abil. Selle protseduuriga saadakse standardne kalibreerimiskõver. Tuleb märkida, et testribade valmistamine, mis on keemiliselt täiesti samad, on üsna raske reagentide väga väikese kontsentratsiooni tõttu. Selle probleemi lahendamiseks kasutatakse standardset kalibreerimiskõverat, mis koosneb 16 kalibreerimisliinist. Kvaliteedikontroll viiakse läbi vahetult pärast testribade valmistamist, mis võimaldab määrata, milliseid kalibreerimisliinidest (1 kuni 16) saab selle katseriba suhtes rakendada. See on nn koodnumber, mis on kinnitatud testriba pakendile. Need 16 kalibreerimisliini on programmeeritud ka mikroprotsessorisse. Optimaalselt täpsete tulemuste saamiseks seadistatakse testribade pakendil näidatud kood koodinupu abil. Seega võib seadme valesti paigaldatud kood põhjustada mõõtmisvea.

Pärast One Touch-seadmete turuletulekut on Venemaal, Ameerikas ja Euroopas tehtud palju laboratoorseid uuringuid. Üks selliseid uuringuid viidi läbi Venemaa Meditsiiniteaduste Akadeemia endokrinoloogilise teaduskeskuse poolt Vene Meditsiinilaboratooriumi diagnostikaliidu taotlusel. Keskuse spetsialistid viisid läbi kahe veresuhkru taseme mõõtmise meetodi võrdleva analüüsi. One Touchi tulemusi võrreldi andmetega, mis saadi Spectrum II biokeemilisel analüsaatoril (Abbott Laboratories, USA), mis rakendab glükoosi määramiseks heksokinaasi meetodit. Uuriti 190 vereproovi 95 patsiendist. Tulemuste korrelatsioonikoefitsient oli 0,98641. One Touch-meetri normaalsete ja patoloogiliste vahemike variatsioonikordaja ei ületa 2,5%.

Vene Meditsiiniakadeemia endokrinoloogilise uurimiskeskuse ametlik aruanne ütles: „One Touch seadmetel on suur täpsus ja täpsus, samuti laiaulatuslikud mõõtmised. Neid saab kasutada diabeedi hädaolukorra diagnoosimiseks, sealhulgas hädaolukordade meeskondade jaoks, sest need seadmed ei ole mitte ainult usaldusväärsed, vaid annavad ka kiiresti tulemusi.

Kokkuvõttes peaksime mainima glükoosi oksüdaasi meetodi puudusi. Saadud vesinikperoksiidi ja superoksiidi anioonradikaal võib oksüdeerida mitte ainult kroomi, vaid ka teisi bioloogilises vedelikus olevaid aineid: askorbiinhapet, kusihapet, bilirubiini. Samal ajal väheneb vastavalt kromogeeni oksüdeerimises osaleva peroksiidi osakaal, mis viib glükoosi tulemuse alahindamiseni. See meetod on reeglina lineaarne kuni 20-30 mmol / l glükoosi.

Hexokinaasi meetod

Registreerimine toimub NADH imendumisel lainepikkusel 340 nm. See meetod on väga spetsiifiline ega reageeri teiste vereseerumi komponentidega. Heksokinaasi meetodit peetakse glükoosi määramise võrdluseks. Reeglina on see lineaarne kuni 50 mmol / l, mis võimaldas seda endokrinoloogiliste osakondadega kliinikutele laialdaselt soovitada.

Kirjeldatud glükoosi määramise meetodite mitmekesisusest saavad QDL-i töötajad ise otsustada, millist määramismeetodit ja millist seadet valida:

  • "Niiske" biokeemia meetodid, mida rakendatakse automaatsetes biokeemilistes analüsaatorites, tagavad suurte analüüsivoogudega laborite vajadused.
  • Bioseni tüüpi glükoosi analüsaatorid vajavad operaatorilt minimaalset pingutust, kuna need on täielikult automatiseeritud ja piisavalt produktiivsed (kiirus 50 kuni 200 proovi tunnis).
  • Väikese arvu uuringutega laboratooriumide ja ekspresslaboratooriumide puhul on mugav spetsiaalne biokeemiline fotomeeter Mikrolab 540.
  • Abimeeskondade jaoks on peitmisabi ideaalne lahendus - vere glükoosimõõturid nagu One Touch.

Seega on QDL-i ülesanne tagada mitte ainult kiire, vaid ka väga täpne glükoosi määramine.

Vere glükoos, uriin, vedelik

Veresuhkru taset kontrollitakse rangelt.

Glükoosi kontsentratsiooni kontroll veres toimub närvi mõjutuste ja hormoonide abil.

Närvisüsteem

Vere glükoosikontsentratsiooni närvi reguleerimine väljendub n.vaguse positiivses toimes insuliini sekretsioonile ja inhibeerivale mõjule sellele sümpaatilise innervatsiooni protsessile. Lisaks mõjutab adrenaliini vabanemine veres sümpaatilist mõju.

Hormonaalne regulatsioon

Peamised hormonaalsed regulatsioonifaktorid on glükagoon, adrenaliin, glükokortikoidid, ühelt poolt somatotroopne hormoon ja teiselt poolt insuliin. Kõik hormoonid, va insuliin, mõjutavad maksa, suurendavad glükeemiat.

Insuliin on ainus hormoon organismis, mille eesmärk on vähendada veresuhkru taset. Selle mõjul imenduvad glükoosid tugevalt lihased ja rasvkoes.

Vere glükoosisisalduse vähenemine insuliiniga saavutatakse järgmistel viisidel:

  • glükoosi üleminek rakkudesse - GluT 4 transportervalkude aktivatsioon tsütoplasma membraanil,
  • glükoosi osalus glükolüüsis - glükoosinaasi sünteesi suurenemine, ensüüm, mida nimetatakse glükoosi lõksuks, teiste oluliste glükolüüsi ensüümide sünteesi stimuleerimine - fosfofrukokranaas, püruvaadi kinaas,
  • suurenenud glükogeeni süntees - glükogeeni süntaasi aktiveerimine ja selle sünteesi stimuleerimine, mis hõlbustab glükoosi ülejäägi muutmist glükogeeniks,
  • pentoosfosfaadi raja aktiveerimine - glükoosi-6-fosfaatdehüdrogenaasi ja 6-fosfoglükonaadi dehüdrogenaasi sünteesi indutseerimine, t
  • suurenenud lipogenees - glükoosi kaasamine triatsüülglütseroolide või fosfolipiidide sünteesi.

Paljud kuded on insuliini toime suhtes täiesti tundlikud, neid nimetatakse insuliinist sõltumatuteks. Nende hulka kuuluvad närvikoe, klaaskeha, lääts, võrkkesta, glomerulaarsed neerurakud, endoteelirakud, munandid ja punased vererakud.

Glükagoon tõstab veresuhkru taset:

  • glükogeeni mobilisatsiooni suurendamine glükogeeni fosforülaasi aktiveerimise kaudu, t
  • glükoneogeneesi stimuleerimine - püruvaat-karboksülaasi, fosfoenolpüruvaadi karboksükinaasi, fruktoosi-1,6-difosfataasi ensüümide töö suurendamine.

Adrenaliin põhjustab hüperglükeemiat:

  • glükogeeni mobiliseerimise aktiveerimine - glükogeeni fosforülaasi stimuleerimine,

Glükokortikoidid suurendavad veresuhkru taset

  • pärssides glükoosi üleminekut rakku,
  • glükoneogeneesi stimuleerimine - ensüümide püruvaadi karboksülaasi, fosfoenolpüruvaadi karboksükinaasi, fruktoosi-1,6-difosfataasi sünteesi suurendamine.

Tabelis on kokku võetud hormonaalse mõju peamised aspektid:

  • Glükogenolüüsi aktiveerimine maksas;
  • Glükoneogeneesi stimuleerimine;
  • Glükoneogeneesi suurenemine;
  • Membraani läbilaskvuse vähenemine glükoosile.

Vere glükoosisisaldus kliinilises praktikas

Üle 90% kõigist lahustuvatest madala molekulmassiga vere süsivesikutest on glükoos; lisaks võib väikestes kogustes esineda fruktoosi, maltoosi, mannoosi ja pentoosi ning patoloogia korral galaktoosi. Koos nendega sisaldub veres valkudega seotud polüsahhariide.

Eriti intensiivselt tarbitakse ja kasutatakse glükoosi kesknärvisüsteemi kudede, punaste vereliblede, neerude naha erinevate vajaduste rahuldamiseks. Vahe-ainevahetuses kasutatakse glükoosi glükogeeni, glütserooli ja rasvhapete, aminohapete, glükuroonhappe ja glükoproteiinide moodustamiseks. Glükoosi kontsentratsioon veres on glükolüüsi ja trikarboksüülhapete oksüdeerumise derivaat TCA tsüklis, glükogenees ja glükogenolüüs maksas ja lihaskoes, glükoneogenees maksas ja neerudes ning glükoosi tarbimine soolest.

Kliinilises praktikas uuritakse tavaliselt veresuhkru taset, teiste suhkrute ja glükogeeni kontsentratsiooni kasutatakse palju harvemini. Inimveres on glükoos plasma ja moodustunud elementide vahel üsna ühtlaselt jaotunud, on kindlaks tehtud, et venoosse veres on suhkrusisaldus 0,25-1,0 mmol / l (keskmiselt 10%) väiksem kui arteriaalses ja kapillaarveres. Teadaoleva diagnostilise väärtusega on piimhappe ja püroviinhapete määratlus, mitmete süsivesikute ainevahetuse ensüümide, siaalide ja heksuroonhapete, seromukoidide, glükosüülitud hemoglobiini ja teiste näitajate aktiivsus.

Glükoosi sisaldus uriinis sõltub selle kontsentratsioonist veres, kuigi see eritub nii normaalses kui ka kõrgenenud veresuhkru tasemes. Glükoosi kontsentratsiooni suurenemisel veres ületab nn neerukünnise (tervetel inimestel see jääb 8,3–9,9 mmol / l) ja glükoosuuria. Diabeediga arteriosklerootilise neeru korral suureneb läviväärtus ja glükoosuria ei pruugi täheldada isegi glükoosi kontsentratsiooni suurenemisega kuni 11,0-12,1 mmol / l.

Vere glükoosisisalduse määramise meetodid

Vere glükoosisisalduse määramise meetodid on jagatud kolme rühma: redutseerimine, kolorimeetriline ja ensümaatiline.

  1. Vähendamismeetodid (Tuleb meeles pidada, et selle rühma meetodid annavad ülehinnatud tulemusi (umbes 20-25%), sest veres on mitmeid ühendeid, mis ei ole seotud süsivesikutega, kuid millel on vähendavad omadused (kusihappe, glutatiooni, kreatiniini, askorbiinse) )):
    • Hagedorn-Jenseni tiitromeetriline meetod põhineb suhkru omadusel taastada, kui keedetakse leeliselises keskkonnas, raua ja sinuse ning raua-sludinaatides. Vastavalt selle taastumise astmele uuritakse suhkru kontsentratsiooni veres titrimeetria abil Meetodi oluline eelis on selle madal hind ja võimalus kasutada seda laboris;
    • põhineb nitrobenseenide redutseerimisel, näiteks pikriinhappel pikramhappeks;
    • meetod, mis põhineb glükoosi võimel vähendada vasksooli. Saadud monovalentne vask toimib vaheühendina. Oksüdeeritakse õhu hapnikuga, taastab arseeni-molübdeenhappe või fosforotunghappe, mis toimib lõpliku kromogeenina.
  2. Kolorimeetrilised meetodid. Nende hulka kuuluvad:
    • Somodzhi meetod - vase-ortronreagendi koostises oleva vase redutseerimisreaktsioon vaskoksiidiks. Meetod on töömahukas, mitmeastmeline, mittespetsiifiline ja praegu praktiliselt ei kasutata;
    • Folin-Wu meetod - vasktartraadi redutseerimine liitiumoksiidiks. Meetod on lihtne, puuduseks on saadud värvi intensiivsuse ja glükoosi kontsentratsiooni vahelise range proportsionaalsuse puudumine;
    • glükoosi kontsentratsiooni määramine Morrise ja Roe'i järgi - glükoosi dehüdratsioon väävelhappe toimel ja selle muundamine oksümetüülfurfuraaliks, mis kondenseerub artrooniga sinise ühendiks. Nõuab puhtamaid reaktiive ja püsivat reaktsiooni temperatuuri ranget järgimist;
    • Gultmani orthotoluidiini meetod Khivarinen-Nikkili modifitseerimisel, mis seisneb lahuse värvimise intensiivsuse määramises, mis tekib siis, kui aromaatne amototolueeniin interakteerub happelises keskkonnas glükoosi aldehüüdi rühmaga. See meetod on täpne ja võimaldab täpsemat glükoosi määramist.
    • Aniliini meetod säilitab ortotolutiini meetodi tundlikkuse, kuid on veelgi spetsiifilisem.
  3. Ensümaatilised meetodid:
    • põhineb heksokinaasi reaktsioonil. Heksokinaasi toimel glükoos fosforüülitakse ATP abil, saadud Gl-6-F dehüdrogenaasi juuresolekul taastab NADP. Viimase koguse määrab valguse neeldumise suurenemine ultraviolettpiirkonnas. Meetod on praktiliste laborite jaoks liiga kallis.
    • põhineb glükoosi oksüdatsioonil glükuroonhappeks ensüümi glükoosi oksüdaasi ja vesinikperoksiidi reaktsiooni tekkimisel, mis (erinevates versioonides):
      • määratud keemiliste vahenditega;
      • peroksidaasi osavõtul oksüdeerib see värvitu orthotolidiini, muutes selle roheliselt sinise värviga ühendiks, värvisõltuvuse suhe glükoosi kontsentratsiooniga jääb vahemikku 1,1 kuni 22 mmol / l;
      • fenooli juuresolekul peroksidaasi osalusel oksüdeerib 4-aminoantipüriin värviliseks värvitu värvusega ühendiks;
      • vaskioonide juuresolekul oksüdeerib ta fenoolftaliini fenoolftaleiiniks, mis on aluselistes tingimustes punane.
  4. Elektrokeemilised meetodid, mis kasutavad immobiliseeritud ensüüme sisaldavaid elektroode, eriti glükoosi oksüdaasi. Reaktsioon registreeritakse moodustunud vesinikperoksiidi koguse või glükoosi oksüdeerimiseks tarbitud hapniku koguse järgi.
  5. Diagnostilised ribad, mis kasutavad kromogeenina glükoosi oksüdaasi-peroksidaasi reaktsiooni ja bensidiini derivaate.

Võeti vastu kolm meetodit: Haggedorn-Jenseni tiitromeetriline meetod, orto-toluidiini meetod ja o-tolidiini glükoosi oksüdaasi meetod.

Glükoosi määramine ortololuidiini meetodil

Põhimõte

Glükoos väävelhappe juuresolekul ortotooliga kuumutamisel annab sinise-rohelise värvi.

Glükoosi määramine glükoosi oksüdaasi meetodil

Glükoosi kontsentratsiooni määramine veres on üks kõige sagedamini teostatud biokeemilisi uuringuid laborites.

Glükoosi oksüdaasi meetod veres ja uriinis sisalduva glükoosi määramiseks põhineb glükoosi oksüdatsiooni reaktsioonil glükoosi oksüdaasi ensüümi juuresolekul, moodustades vesinikperoksiidi, mis omakorda peroksidaasi juuresolekul oksüdeerib orthotoluidiini värviliste toodete moodustamiseks; glükoosi kontsentratsiooni hinnatakse värvitud toodete arvu järgi.

Kuna glükoosi oksüdaasi meetod on suunatud glükoosi ja mitte kõigi suhkruliikide identifitseerimisele, kasutatakse seda järgmiste haiguste diferentsiaaldiagnostikas:

Põhimõte

Glükoos ensüümi glükoosi oksüdaasi juuresolekul oksüdeerub atmosfääri hapnikuga, moodustades reaktsiooni käigus vesinikperoksiidi. Vesinikperoksiid peroksidaasensüümi juuresolekul oksüdeerib ortotolutidiini, moodustades värvilise ühendi, mille värvi intensiivsus on proportsionaalne glükoosisisaldusega.

Glükoosi oksüdaasi meetod võimaldab määrata glükoosi taset vereplasmas, seerumis ja tserebrospinaalvedelikus.

Norm mmol / l

- plasmas, natsheartse'is

  • vastsündinud - 1,7 - 4,2
  • 6-nädalased kuni 15-aastased lapsed - 3,3–5,4
  • täiskasvanud (mehed, naised) - 3,8 - 5,5

- seerumis, natsheartse

  • vastsündinud - 2.6 - 4.2
  • lapsed alates 6 nädalast kuni 2 aastani - 3,3 - 5,4
  • täiskasvanud (mehed, naised) - 3,8 - 5,5

Reaktiivid

1. Naatriumkloriid 9 grammi liitri kohta (isotooniline lahus): valmistatud 0,9 g NaCl lahustamisega 100 ml vees.

2. Tsinksulfaat, 50 g / l: 5 g tsinksulfaati (ZnSO4) lahustatakse vees, ruumala viiakse 100 ml-ni.

3. Naatriumhüdroksiid, 0,3 mol / l: valmistatud, lahustades 1,2 g NaOH 100 ml vees, kontsentratsiooni kontrollitakse tiitrimisega (see peaks olema 0,3 n).

4. Orthotolidiin, 1% lahus: 1 g ravimit lahustatakse 100 ml absoluutses alkoholis. Lahust võib hoida külmkapis klaasist korgiga kolvis mitu kuud. Kaubanduslikult saadavat produkti saab puhastada ümberkristallimise teel, mille jaoks see lahustatakse absoluutses alkoholis, lisatakse vett ja sadestunud kristallid imetakse filtril välja, seejärel kuivatatakse kaltsiumkloriidi kohal.

5. Atsetaatpuhverlahus pH 4,8: ​​segatakse 4 osa 0,25 n äädikhapet (kontrollitakse tiitrimise teel) ja 6 osa 0,25 n naatriumatsetaati (sisaldab 34 g CH3COONa X ЗН2О 1 liitris).

6. Glükoosi oksüdaas on kuivpreparaat, mille aktiivsus on 3000 ühikut / mg või rohkem.

7. Mädarõika peroksidaas. 1 mg lahustatakse 5 ml atsetaatpuhvris, seda võib hoida külmkapis mitu päeva.

8. Tööreagens: 2 mg glükoosi oksüdaasi ja 1 mg peroksidaasi lahustatakse 80 ml atsetaatpuhvris, lisatakse 1 ml 1% ortotolueeniini lahust, segatakse ja viiakse lahus 100 ml-ni puhverlahusega. Tööreagens peab olema läbipaistev, värvitu või nõrga rohelise tooniga, millisel juhul see on külmades säilitades stabiilne. Kui värv on intensiivne või mõne tunni pärast pärast valmistamist hakkab sade langema, tähendab see, et ortotoluidiin ei ole piisavalt puhas ja vajab ümberkristallimist.

9. Glükoosilahuste kalibreerimine. Glükoosi kuivatatakse temperatuuril 37 ° C ja säilitatakse eksikaatoris. Esmalt valmistage aluslahus kontsentratsiooniga 50 mmol / l, mille jaoks lahustatakse 180 mg bensoehappe küllastunud lahuses (ligikaudu 0,3%). Sellest lahusest valmistatakse 3-kordselt töötavad kalibreerimislahused; 6; 9; 12; 15; 18 ja 21 mmol / l, mille puhul nad võtavad 0,6; 1.2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 ja 4,2 ml aluselist lahust ning viiakse bensoehappe küllastunud lahus mahuni 10 ml. Need lahused sisaldavad glükoosi samades kontsentratsioonides nagu veres, mis hõlbustab kalkuleerimist kalibreerimise ajal.

Määratlemisviis

Tsentrifuugikatsutites segatakse 1,1 ml naatriumkloriidi lahust, 0,4 ml tsingisulfaadi lahust ja 0,4 ml 0,3 n NaOH lahust; samal ajal moodustub väga õhuke tsinkhüdroksiidi geel, 0,1 ml verd või kalibreerimislahust vabastatakse, segatakse uuesti ja tsentrifuugitakse 10 minuti pärast kiirusel 3000 p / min 10 minutit.

1 ml supernatandile lisatakse 3 ml tööreagenti ja segage õrnalt.

Värv hakkab järk-järgult arenema, mis normaalse toatemperatuuril jõuab maksimaalselt 13-15 minuti jooksul ja seejärel järk-järgult väheneb. Fotomeetriliselt alati pärast sama ajavahemikku pärast tööreagendi lisamist küvettidesse, mille optilise tee pikkus on 1 sentimeeter punase valgusfiltriga (lainepikkus 625 nm) tühikäigu kogemuse vastu, mis määratakse samaaegselt töötavate proovidega, kuid veri asemel võetakse füsioloogiline naatriumkloriidi lahus.

Kalibreerimisgraafiku ettevalmistamisel võetakse vereproovide asemel 0,1 ml sobivat kalibreerimislahust.

Glükoosi arvutamine võib toimuda vastavalt proportsioonireeglitele või kalibreerimisgraafikule, et ehitada glükoosi kontsentratsioon (mmol / l) ühele teljele ja ekstinktsiooniväärtus teisel.

Märkused

1. Esmalt võib verd pipetist vabastada naatriumkloriidi isotoonilisse lahusesse ja seejärel lisada tsinksulfaadi ja NaOH lahused.

2. Süstemaatilise töö korral ei ole vaja pidevalt kalibreerimiskava koostada kõigi punktide jaoks, piisab tühja proovi töötlemisest ja 2-3 punktist vahemikus 3–9 mmol / l päevas ning ehitada täielik kalibreerimisgraafik ainult reaktiivide vahetamisel või protseduuri kohandamisel.

Loe Lähemalt Diabeet

Diabeedi Sümptomid

Glükeemiline Indeks